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成立于1970年中期,新英格兰生物实验室公司(NEB)是在酶的分子生物学应用的发现和生产行业的领导者,现在提供基因组研究重组和天然酶的最大的选择。bob网站appNEB继续扩大其产品供应到相关的PCR,基因表达,用于下一代测序,合成生物学,糖生物学,表观遗传学和RNA分析的样品制备区域。bob网站app此外,NEB的重点是加强联盟,促进新技术,以达到主要市场领域,包括分子诊断发展。新英格兰生物实验室是一家私人控股公司,总部设在伊普斯维奇,MA,并拥有独家通过经销商,代理商及七个子公司设在加拿大,中国,法国,德国,日本,新加坡和英国的网络在全球拥有广泛的分布。有关新英格兰生物实验室更多信息请访问

在限制性消化提示:设计屏幕的限制

内容赞助新英格兰生物实验室

限制性消化很简单。但后果自负低估他们。限制性消化,是许多程序在分子生物学的基石,以便让他们的权利,并知道如何告诉,如果他们走错了,是一项基本技能。bob网站app屏幕限制,其中向量使用限制性内切酶,以产生多个频带消化,是一种简单有效的方法来确定是否您的克隆含有的所需插入片段。载体和插入可以包含许多不同的限制性酶切位点,使得它混淆选择设计限制画面时产生可解释的结果的酶。添加一个事实,即并非所有的限制性内切酶是相等的(一些可能有问题与工作),并设计限制屏幕可以是一个艰巨的任务。

本快速指南设置和故障排除限制屏幕会告诉你你需要知道的东西。

一步一步指南设计一个屏幕限制

第1步。可用酶的列表

每个实验室技术和他的狗有限制的股票可用酶在他的处置那么为什么不使用有什么可用?写下(排名不分先后),你必须提供给您的限制性内切酶(这可能是你个人的股票,实验室股票,或者那些从其他实验室,如果你上有足够的交情)的列表。找出任何潜在的恶作剧限制性内切酶,并尽量避免它们(我把*号的旁边)。问题的酶可能是这些:

  • 由甲基化抑制,如XbaI位。
  • 需要孵育超过37其他温度ØC.例如,BSLI要求55的温育温度ØC,而SmaI位要求25的温育温度ØC.你可以找到孵化温度的细节NEB的限制性内切酶图
  • 或者只是酶是不友好无论出于何种原因。

第2步:确定网站在INSERT

识别您的插入限制性酶切位点。NEBcutter V2.0是可以用来快速识别的DNA序列限制性酶切位点一个自由和非常方便的工具。如果你能识别你插入两个站点,这将产生一个像样的大小的条带下面消化这是伟大的,因为这将通过包括只插入带增加屏幕的功耗。

第3步:确定网站在你的载体

看看在插入正在使用的限制性酶切位点也存在于载体和确定什么尺寸的带会产生。然后,选择在所需要的消化的MCS的5` 3`和两侧和周围的矢量矢量矢量许多限制性酶切位点。选择将产生在你的屏幕的限制相当规模的,可识别的带酶切位点。

第4步:执行限制屏幕

尝试屏!并希望它会工作。如果不是,分析为什么它可能没有工作;回到你的计划和工作了哪些网站可能存在于克隆给你所得到的结果。可取的是执行与不同的酶的第二屏幕,以确认所述第一屏幕的结果。

希望这个过程将需要你到更好,更翔实的限制,屏幕,这样当绊脚石不一起走,你能超过它,然后继续你的快乐后的克隆方式直蹦。

故障排除限制屏幕

限制性消化能产生意想不到的结果或失败的原因有多种。这是一个通过,如果你的消化是给你在所有令人惊讶的结果还是没有结果清单工作:

  • 限制性内切酶失去了活性。这可能是由于年龄,反复冻融或贮存不当。检查每个单独的酶(如果使用多种酶)与阳性对照(比如你知道一个向量应该给你带)。
  • 限制性内切酶是通过甲基化抑制(当它们的识别序列被甲基化的一些限制性内切酶被阻止)。
  • 酶在不正确的温度下温育。通过仔细检查孵化温度为您酶NEB的限制性内切酶图
  • 使用不兼容的缓冲液中。NEB的限制性内切酶图还提供兼容的缓冲液的细节。一些酶的活性可在某些缓冲器被减小。当使用多种酶需要以确保所有的酶是活性在您所使用的缓冲液可以接受的水平。
  • 太多DNA或太多酶是在反应(这将产生一个梯)。
  • 载体或插入件具有一个缺失。
  • 不完全的消化(酶是没有充分发挥作用)。
  • 限制网站被添加或删除。
  • 载体制备是脏并且可以含有抑制消化反应污染物。再进行预习(例如小量)如果您担心这一点。
  • 太多酶,高离子强度或高甘油引起的星活性(星活性是酶裂开sitethat是类似的,但不相同,其标准的切割位点的位置。
  • 克隆实际上是负的,该死的!

当限制屏幕失败好的做法是设置另一个摘要一组不同的酶。希望你已经把你的设计你的限制屏幕,让你可以使用替代酶的想法时,做了笔记。就像没有早上喝咖啡的上司,限制屏幕可有时很难解释和第二组带真的可以帮助工作发生了什么事情。

当克隆的限制屏幕出现故障,它质疑您的数据,是很重要的一定要知道它确实是一个负数。有时显然阴性克隆实际上是积极的和克隆神都只是在玩硬碰硬(或有人拔掉你的冰箱和摧毁你的酶没有你实现)。

设置最翔实消化可能的,并通过检查表上面去帮助你与此并能避免任何重复同样的错误或节省宝贵的时间和资源重新克隆时,你已经拥有你想要的克隆插入!

你有没有进行限制屏幕什么秘诀?

最初发表在8月11日,2008年更新和2020年01月07日修订。

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