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DNA结扎:它的工作原理和6个主要技巧

一个拿着粘带的男人描绘了DNA连接的过程

了解实验室中最常用的分子生物学技术背后的基本(和简单!)化学反应并不只是增强您对科学的理解;bob网站app这将帮助您获得更好的结果。继续阅读以获取有关DNA连接基础知识的简短底漆,以及一些方便的提示,以优化您的DNA连接反应。

从事工作的酶:DNA连接酶

DNA连接酶(EC6.5.1.1)是DNA连接反应核心的酶。简而言之,DNA连接酶将两个DNA粘在一起!或者,更科学地,DNA连接酶与钝器或钝器或兼容的内聚端(见图1)。

DNA连接的凝聚力和钝端
图1.凝聚力和钝的末端,准备进行DNA连接!

在活生物体中,DNA连接酶是重要的酶,在DNA复制和修复中,特别是在DNA分子中的双链断裂中进行关键作用。

对实验室中的克隆和非克隆应用进行DNA连接。DNA连接在非锁定应用中使用的一个例子包括构建下一代DNA测序文库。这些过程使用DNA连接酶将专门的适配器连接到DNA片段的两端,以进行后续测序。

对于克隆应用,DNA连接酶通常用于将限制酶生成的DNA片段插入载体骨架中。商业连接酶提供了含有ATP和MG的反应缓冲液2+,这两个对于连接酶活性都是必不可少的。

DNA连接反应的两个步骤

DNA连接反应本身有两个基本步骤:

  1. 首先,DNA末端必须偶然碰撞,并保持足够长的时间,以使连接酶加入它们。
  2. 第二步是酶促反应,该反应示意性地显示在图2。DNA连接酶通过两步机制催化3'-OH与5'-磷酸盐的连接。
    首先,将AMP核苷酸连接到酶活性位点中的赖氨酸残基,被转移到5'-磷酸盐。
    然后,AMP - 磷酸键被3'-OH攻击,形成共价键并释放AMP。为了允许酶进行进一步的反应,ATP必须在酶的活性部位补充AMP。
DNA连接机理
图2. DNA连接的酶促反应

6个用于优化克隆DNA连接反应的技巧

DNA绑扎可能令人沮丧。有时他们没有出于明显的原因无法工作。

我们的前6个DNA连接技巧应提高您的绑扎效率,并希望提高您的克隆成功率!

1.降低温度

DNA连接反应的第二部分是反应中最低效率的部分,但在低温下更容易。

为什么?好吧,正如您可能会知道的那样,所有分子在较高的温度下移动得更快,因此您可以想象,如果两个DNA末端碰撞并保持在一起,如果它们在低温下溶液中浮动而不是搅拌,则将更容易碰撞并保持在一起。大约在较高的温度下。

有凝聚力末端的其他原因。较低的温度稳定了互补核苷酸之间的氢键,这确实有助于将物体固定在适当的位置。

DNA连接酶在25°C下具有最佳活性,因此在温度下进行连接反应,这是将DNA末端(1°C)和酶促反应的最佳温度之间的权衡(25°)(25°)C)。

通常,在16°C下1小时是细的,但是由于将DNA末端放在一起是反应的最低效率部分,从而通过将温度降低到4°C可以带来更高的效率。但是,该酶在此温度下工作得非常缓慢,因此需要长时间(例如,一夜之间)的孵育时间。

2.等分连接酶缓冲液

连接酶缓冲液中的ATP对于DNA连接反应至关重要,但可以通过反复的冻融周期分解。为避免这种情况,请从每个新的DNA连接酶中的连接酶缓冲液等分。

使等分试样变得足够小,以进行一次性使用(例如5 µL),并确保在等分试点之前完全除霜并混合。

3.在连接前加热DNA

设置粘性连接时,首先混合矢量并插入片段,然后加热至65°C 5分钟,然后再添加剩余的反应成分。

此加热步骤破坏了任何媒介/矢量或插入/插入凝聚端相互作用,否则可能会干扰所需的矢量/插入相互作用,从而降低连接效率。

4.检查PH

DNA连接的最佳pH范围在7.6至8.0之间。根据如何制备DNA片段,连接混合物的pH值可能不在该范围之外。

您可以通过将大约0.2 µL的混合物移动到窄范围pH纸(例如pH 6-8)上来检查连接混合物的pH值。如果需要,请使用0.2 µL的2M Tris碱基或1M HCl调节pH。

5.包括聚乙烯乙二醇(PEG)

与任何化学反应一样,反应成分的浓度可以极大地影响连接反应的速度。PEG是一种疏水分子,占据反应中的空间,有效地增加了水反应成分的浓度,例如DNA,ATP和连接酶。

将PEG(例如PEG 8000)添加到5-15%的最终浓度可能会提高结扎效率。请记住,PEG浓度高于5%可以降低转化效率。另外,含有钉子的连接反应的热灭活或扩展孵育也可以降低转化效率。

6.在转化之前添加限制酶

这种整洁的技巧可用于规避未消化的向量产生的高背景。如果是矢量片段去除在制备摘要期间,包含一个唯一的限制位点,将相应的限制酶添加到连接反应中将有选择地消化任何完整的向量,从而阻止其转化。

转化前5-10分钟加入1 µL的酶应该足够。

DNA连接总结

希望我们已经展示了DNA连接反应的最佳条件是DNA分子相互作用与酶结扎反应之间的微妙平衡。我们希望这些信息和最重要的技巧可以帮助您取得成功。

想进一步了解DNA连接吗?发现原因T4 DNA连接酶是如此流行的连接酶也许您将需要的唯一连接酶。

我们是否错过了连接反应的最佳提示?在下面发表评论!

最初于2007年10月31日出版;更新和重新发布2022年5月

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10条评论

  1. Neha 2019年10月9日上午10:36

    如果在连接混合物中使用DATP代替ATP,则可能对连接有何影响?



  2. Sourabh Gurav 2018年10月29日下午5:04

    这是我需要的简短而精确的解释!希望看到更多有关生物信息学的文章……。
    感谢帮助 ????



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