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组织学固定导论:固定前要三思!

修理工在修理汽车前思考的图像,代表在进行组织学固定前的思考

对于许多细胞或基于组织的实验,组织学显微镜很可能是终点。在这一系列的文章中,我们想说明一些关于组织或细胞收集、固定、处理、随后的染色、显微成像和分析的不同阶段的联合思考将如何产生更好的结果。

在这篇文章中,我们着重于组织学固定的关键步骤。

组织学固定的目的

固定的目的是将细胞或组织保存在尽可能接近生命的状态,防止自溶和腐烂,并在随后的加工过程中保护组织免受损伤。固定剂有不同的作用:例如,交联,沉淀,凝固。它们也有不同的穿透率,通常以每小时每毫米的穿透深度来衡量。

我通常建议将20倍体积的固定剂固定在组织上,并固定一致的时间。例如,我通常将0.5厘米厚的样品固定在至少一个尺寸的中性缓冲福尔马林24小时,或在Bouin的溶液中6小时。

然后,在加工之前,我将样品转移到70%的乙醇中(许多常规石蜡加工协议的第一步)。

为什么组织学固定选择很重要

细胞和组织的正确固定不仅对保持细胞或组织尽可能接近生命状态至关重要,而且确保染色或荧光具有良好的成像强度也很重要。

强烈的染色良好的荧光细胞或组织将使成像更容易,无论你使用广域,共聚焦,或超分辨率显微镜。通过使用适当的检测系统和适当的固定细胞或组织,可以获得良好的染色效果。

组织学固定前需要考虑的10件事

现在我们知道为什么组织固定是重要的,让我们看看在固定组织之前你需要考虑什么。

1.选择合适的温度

在组织学固定中,温度是一个重要的考虑因素:低温会减少组织的自溶,但导致较慢的穿透速度,所以选择对你来说重要的。

我通常在室温下固定,但对于要加工成树脂的组织或一些敏感抗原,建议低温固定。

2.考虑终点

固定剂的选择由终点决定。例如,如果在树脂切片上的光镜或电子显微镜需要高度的形态保存,那么戊二醛固定剂(可能与多聚甲醛结合)可能是选择的方法。

由于这两种方法都不能有效地保存脂质(脂质在随后的树脂或塑料加工过程中会丢失),组织需要在四氧化锇中进行后固定。

3.了解固定剂的缺点

了解对你的固定剂的否定是非常重要的,以便在将其应用于贵重样品之前,您可以在掌握之前做出明智的决定。

例如,戊二醛渗透组织缓慢,这意味着组织块需要更小或固定时间更长。

然而,就像生活中的许多事情一样,要获得这种高度的形态保存是有代价的。一般来说,执行经验染色技术(例如苏木精和伊红不是或使用抗体(如免疫组化)或核酸探针(如免疫组化)的分子组织探测技术。原位杂交(ISH)]。

学习什么常见的组织学固定剂对你的样本的影响是一种既能理解固定物的优点又能理解它的缺点的方法。

4.考虑到低温恒温器

天平的另一端是使用冷冻切片(或低温恒温器),不固定或很少固定。例如,冷冻切片可以在载玻片上风干,然后直接染色。

因此,它没有固定剂或酒精、溶剂的化学暴露,也没有石蜡加工过程中产生的热量。

对于某些技术来说,这有巨大的优势:例如,在脂质、免疫组化和某些抗原的免疫荧光显示中,以及在脑组织中,它可以提供良好的结果。然而,总的来说,其他组织的形态学较差,使得这种选择不太主流。

5.如果有疑问,走中间路线

就像我们的政客一样,当涉及到固定的时候,我们大多数人都试图寻求中间立场!目前,固定的中间地带是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。

它在病理诊断中被广泛使用。病理学家熟悉组织的染色质模式以这种方式固定,它提供了良好的形态保存和化学保存,如蛋白质被很好地保存,尽管经常被掩盖(这可以撤消),mRNA和DNA也可以杂交。

6.要知道不同的学科有不同的偏好

抗体制造商经常给出在FFPE组织上使用的条件,可能是因为他们已经在这种容易获得的样本上优化和验证了这些试剂。但就像政党一样,不同的学科有不同的偏好!例如,在我们的一个研究中心研究巨噬细胞时,Methacarn是首选的固定剂。

7.没有一个统一的解决方案可以解决所有这些问题

正如标题所说:“在你修正之前要三思”。这并不意味着4%的中性缓冲甲醛是每一种应用的最佳固定剂,事实上,它可能不利于在基于抗体的实验中获得最佳结果,或确实不利于形态保存。

8.组织决定组织固定

例如,在90年代早期,我曾研究精子发生,因此研究了睾丸。睾丸是一个相当充满液体的器官,由不同种类的细胞组成,这些细胞包含在两个主要的室间,即小管和间质。

在大鼠中,精子发生有14个阶段,因此在睾丸的任何横截面上,输精管都可以被描述为14个阶段中的一个。这些阶段是由不同细胞类型在形态上的细微差别来区分的。在睾丸中,我想用ISH来观察mRNA的表达。大多数文献推荐4%多聚甲醛用于ISH。

9.尝试不同的注视

那么我选了哪种定影剂呢?

答案当然是,我们选择了,好吧.........几个!至少在初步评估中是这样的!

原因是,我们可以从已发表的文献中看到,多聚甲醛不能提供识别睾丸细胞群细微差异所需的形态保存程度。

我们可能会得到一个mRNA信号,但如果我们不能准确地识别精子发生的细胞类型和阶段,那么获得的信息就没有什么价值。所以我们选择了几种,最后,我们选择了Bouin的溶液,虽然它的ISH给出的信号稍微不那么敏感,但提供了需要的形态保存,以确定基因在精子发生的哪个阶段表达。

也许我是幸运的,因为这些20年的样本今天仍然可以用于ISH,并且在我的手中证明它是一种非常好的免疫组化固定剂。

我会建议你在Bouin的解决方案中修复所有的东西吗?当然不是!对于我们的组织和我们期望的终点来说,它是理想的固定剂,但这并不意味着它适用于所有应用。找到理想的固定剂可能需要尝试不同的固定样品的方法,以不同的方式准备它们,以及应用不同的染色策略。

对于大多数应用来说,坚持中间立场当然是一种很好的固定策略,但如果它没有给您所需的端点,或者根本不起作用,那么请保持开放的心态,探索不同的固定策略,以获得最好的结果。在项目开始的时候这样做,这样你就可以灵活地改变方向。

10.是一致的

最后,一旦你做出了固定选择(例如固定剂、时间和温度),那么就保持一致,谁知道呢,你可能在20年后还在使用这些样品!

最初发布于2012年7月17日。审查和更新了2021年8月。

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