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免疫组化 - 机器人的介绍,技术和进化!

免疫组化 - 机器人的介绍,技术和进化!

过去二十年来,使用免疫组织化学(IHC)作为研究工具的出版物数量的显着增加,以确定细胞,组织切片和全架制剂中感兴趣的蛋白质的空间位置。

研磨和装订

对“研磨和绑定”方法的优点是显而易见的,但是只有当该技术被视为过程的一部分而不是事件本身时,才能获得最佳结果。我不知道任何人那些作为独立技术做免疫学的人。它是涉及组织固定,加工和切片的过程的一部分。免疫组织没有结束游戏,微观成像是。只有考虑过程中的所有阶段,只能获得染色的细胞或部分,这最终将导致正在获得的最佳图像。

两个起动技巧

今天的研究人员有许多技术和试剂技术。当我第一次开始在诊断实验室内进行IHC时,我们使用了两种基本技术。PAP方法(过氧化物抗过氧化物酶)和间接方法;

  • PAP方法是最敏感的,因为它能够与其缀合的缀合的马萝卜过氧化物酶(HRP)酶,导致与其基材的孵育时更强的反应,二氨基苯胺(DAB)。我仍然看到了定期使用间接方法的研究人员(对于Western Blots和IHC),因为它是一种简单的执行技术。基本上,将初生抗体与靶蛋白一起孵育,然后用选择标记(酶,荧光染料,纳米盘等)的二次抗体结合,然后可以可视化。
  • 间接方法具有很大的通用性,因为您可以通过改变标记的次级来可视化您的靶蛋白,这比直接标记的主要抗体更通用。由于开发了抗抗杀螨剂 - 生物素检测系统和链霉抗生物素蛋白检测系统,PAP方法很快。这些证明是更敏感和更快的表演。

抗生物素蛋白 - 生物素或链霉抗生物素蛋白系统还提供许多不同的链霉抗生物素蛋白标签。唯一真正的缺点是某些组织含有高水平的内源性生物素,当然,您的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白将以高亲和力结合给出假阳性染色。抗霉素 - 生物素阻断试剂可以应用于消除该染色的细胞或切片,但增加时间和费用。

不断的演变

免疫检测是一个不断发展的领域,研究人员将拥有自己的个人喜好。

目前我使用今天可用的两个最敏感的检测系统;

  • 首先是基于聚合物的试剂,其中二次抗体与聚合物骨架结合,大量酶可以是共轭的 - 通常是HRP或碱性磷酸酶。这对于Crometric Colocalization研究特别有用。若干制造商生产它们,可用于鼠标,兔子,大鼠,山羊和羊原初(但也是我怀疑的其他人)。聚合物系统大量用于机器人染色系统,并没有与链霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白的系统相关的缺陷。
  • 我的第二种选择系统是基于酪酰胺的检测。基于酪酰胺的检测需要HRP中间体。我使用HRP缀合的聚合物试剂或常规的仲次来检测目的的主要抗体。当酪酰胺用于此时,HRP催化标记的酪酰胺的沉积,其又在抗体结合和您感兴趣的蛋白质周围给出了大量的信号放大。同样,这具有良好的敏感性,并且由于尺寸的可用性,存在广泛的多色或荧光端点。

Tyramide Systems在分层化研究中也具有独特的优势,但这是另一篇文章......

前方令人兴奋的时刻!

分子组织探测领域正在进入一个非常激动的时间,我只能设想其在未来几十年中的普及。免疫组织化学,免疫荧光,免疫组织化学和免疫荧光分层,原位接近结扎,原位杂交和Rnascope等技术为今天的研究人员提供了前所未有的灵活性,用于检查细胞和组织内蛋白质,mRNA和DNA的空间位置。此外,随着超分辨率显微镜的出现,我们将能够检查前所未有的细节中的微小结构。

一个漫长的一个阶段

如果您从本文中删除了其他任何措施,请记住,分子组织探测仍然只是该过程中的阶段,并且必须考虑所有阶段加入思考,以产生最终结果!

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