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免疫组化-直接与间接方法,黄金法则

免疫组化-直接与间接方法,黄金法则

在我前一篇文章我在浅层覆盖了不同的免疫组化染色技术。在下面的文章中,我将开始更详细地解释这些技术,以及在哪些情况下应该应用它们。

在应用这些方法时,以下所有步骤都将涉及额外的阶段,例如:血清阻断、蛋白质阻断、亲和素生物素阻断、过氧化物酶阻断等等,但在本文(和第2部分)中,我们将只关注检测原理。

直接法

直接法使用直接标记的一抗。它们可以是已经贴上标签的产品,也可以由研究人员自行贴上标签,使用适当的化学物质,例如HRP标签http://www.scribd.com/doc/17410323/How-to-HRP-Label-and-Purify-Your-Antibody-No-HPLC-Needed

但它并没有所有的答案

直接法缺乏一些通用性,因为它不像所谓的“三明治”方法那样敏感。

此外,你的一抗现在被贴上了标签,可能不适合未来的应用。最后一个缺点是直接标记的一抗范围有限,如果你需要在实验室标记抗体,那么这就涉及到时间问题。

直接法可用于目标蛋白丰富且一抗特异性高的共定位实验中一抗的荧光标记等应用。

一个当前的应用程序…关注这个空间!

这里有一个当前问题的例子,直接方法可以提供一个解决方案。我正在考虑的一个具体应用是小鼠对小鼠的检测(“MOM”,即应用于小鼠细胞或组织的小鼠单克隆抗体)。通常我会使用一个专有的MOM工具包,但我目前有一个问题抗体!一抗能提供所需的染色效果,但背景高。在用尽其他选择后,可以通过标记一抗.....来消除本底染色看这个空间。理论上,这应该会改善背景,因为在检测中不涉及“抗小鼠”试剂,但问题是,它会有所需的敏感性吗?

间接法

间接法使用标记的二抗,比直接法具有更大的灵活性。有一个大范围的荧光团,半抗原或酶标记的二次试剂可供研究人员。这意味着您可以根据所需的端点以各种方式检测一抗。

金科玉律——牢牢记住

间接法仍广泛用于流式细胞术、western blotting和免疫组化检测。BOB棋牌这就是免疫组化的黄金法则之一;记住它,你将永远不会后悔。规则是使用与二抗相同物种的正常血清进行阻断。

例如,如果你使用兔一抗和山羊抗兔HRP二抗,你应该在使用一抗之前使用正常山羊血清进行血清阻断步骤。阻断血清的浓度不同(在2.5%到20%之间),但目的是阻断细胞或组织上的任何位点,在这种情况下,山羊IgG会与这些位点结合。通过用正常的IgG阻断这些位点,你标记的次级抗体将无法与它们结合,从而防止假阳性染色。

不完全是敏感的

如果直接方法具有链霉亲和素或聚合物检测方法的灵敏度,它将被广泛使用,但与这些技术相比,它是相对不敏感的。

在第二部分,我们将学习PAP, APPAP和三明治。是的,三明治!

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