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DNA提取试剂盒在实验室是如何工作的

DNA提取

在Bibob综合博彩teSize Bio,我们分享了很多故障排除提示核糖核酸和基因组DNA提取,因为我们在分子生物学中的几乎所有内容都需要核酸分离作为第一步。bob网站app如今,大多数实验室使用基于旋转柱技术的商业DNA提取套件。旋转柱含有二氧化硅树脂,其选择性地结合DNA(或RNA),这取决于盐条件和受萃取方法影响的其他因素。结果是克隆的高质量材料,长期的测序长阅读测序,命名一些潜在的应用程序。

基因组DNA提取工具包通常比传统方法更容易和更快地使用,并且不需要大量的专业知识。然而,缺点是,如果您不了解您的套件的黑盒中有什么,那么故障排除可能会很困难!

在这篇文章中,我们将一步一步地通过RNA和DNA提取试剂盒的原则。我们也将看看一些常见的问题与硅柱,你可以克服一些简单的技巧!

第一步:细胞裂解

裂解公式可能不同,取决于你想提取DNA或RNA。一般来说,裂解缓冲液中含有高浓度的混沌性盐。混沌理论在核酸提取中有两个重要的作用。首先,它们破坏氢键、范德华力和疏水相互作用,导致蛋白质(包括核酸酶)的不稳定。其次,它们破坏了核酸与水的联系,从而为它们转移到二氧化硅提供了最佳条件。

混乱盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

除了络杂交之外,裂解缓冲液中通常存在洗涤剂,以帮助蛋白质溶解和细胞裂解。根据样品类型,酶也可以在此特征。广谱丝氨酸蛋白酶K在消化核酸制剂的消化蛋白质中非常有效。蛋白酶K在蛋白质变性条件下最佳地工作(即在变性裂解缓冲液中)。另一种浓郁的酶,溶菌酶,在变性条件下不起作用,并且在添加变性盐之前将是最活跃的。

请记住,质粒分离的裂解与RNA或基因组DNA提取的裂解非常不同,因为必须首先从基因组DNA中分离出质粒。混沌体的加入将同时释放所有类型的DNA,失去区分小环状DNA和高分子量染色体的能力。因此,在质粒制备中,混沌粒子直到细胞裂解后才加入。如果想了解更多的信息,请查看这些优秀的文章碱性溶菌作用提取质粒和基因组DNA

步骤2:纯化-将核酸结合到柱上

如上所述,混沌盐对于裂解和结合到柱上是至关重要的。添加酒精(有时异丙醇)将进一步增强和影响核酸与二氧化硅的结合。

请注意使用的乙醇的百分比和体积是重要的。过多的乙醇将降低降解材料和小物种,将影响UV260读数。另一方面,太少的乙醇可能会阻碍盐从膜上的清洗。幸运的是,乙醇的添加量将是你使用的工具包的最佳。然而,如果你怀疑降解的DNA使你的OD260读数膨胀,你可以考虑重新优化乙醇浓度。

另一个有用的技巧是保存流动和沉淀它,看看你是否能找到你丢失的材料。如果你使用含有sds的清洁剂进行溶解,试着使用氯化钠作为沉淀剂避免洗涤剂污染你的核酸。

第3步:洗涤

通过硅胶膜离心裂解液后,所需的核酸应与柱结合,杂质如蛋白质和多糖应在流过。然而,膜将含有蛋白质和盐残基。此时,植物样本很可能含有多糖和色素,而血液样本的膜颜色可能略呈棕色或黄色。洗涤步骤可以除去这些杂质。

通常有两个清洗步骤,尽管这取决于样本类型。第一次洗涤通常包括低浓度的无序盐,以去除残留的蛋白质和色素。然后用乙醇清洗以除去盐。如果样本开始时不含有大量的蛋白质(如质粒准备或PCR清洗),乙醇清洗就足够了。

除去混沌盐是获得高收率和高纯度的关键。有些套件实际上推荐两种乙醇洗涤。残留的盐会阻碍核酸的洗脱,导致产率低,A230读数高,260/230比值低。

步骤4:无旋旋用于乙醇的DNA和RNA

大多数方案包括洗涤后的离心步骤,以干燥残留乙醇柱,并且该步骤对于清洁洗脱液至关重要。随后加入10mM Tris缓冲液或水至膜将水合物水合物,从而从膜中洗脱它们。此时膜上的残留乙醇将防止核酸的完全水化和洗脱。

你在分光光度计上看不到乙醇,但它的存在的一个很好的指示器是,即使有加载染料,样本也不会沉入琼脂糖凝胶的孔中。乙醇污染的另一个指标是在-20°C下不冻结的样品。

第五步:最后的边界-洗脱

DNA提取方案的最后一步是从二氧化硅中释放纯DNA或RNA。

对于DNA提取,通常使用pH8-9的10mM Tris。DNA在略微碱性pH下更稳定,并将在缓冲液中溶解比水更快。即使对于DNA颗粒,这也是如此。水倾向于具有4-5的pH较低,并且在用于洗脱的短时间内,高分子量DNA可能不会完全再水化。对于最大DNA洗脱,允许缓冲液在离心前几分钟静置在膜中。对于需要完整的高分子量DNA的应用,例如长距离测序和长读取测序,洗脱缓冲液是最佳选择。

然而,RNA可以耐受微酸性的pH值,并且很容易溶于水,因此它是首选的稀释液。

在RNA和DNA提取过程中还会出现什么问题呢?

低产量

如果您经历较低的收益率,则需要考虑许多因素。它通常是一种裂解问题,不完全裂解是低产量的主要原因。绑定条件不正确是另一种可能性。确保使用新鲜的高品质乙醇(100%200个证据)来稀释缓冲液和结合步骤。低质量的乙醇或旧股票可能已经占用水,歪斜实际的工作浓度。请记住,如果您将洗涤缓冲区不正确,您可能会清洗所提取的DNA或RNA!

低纯度

如果提取液被蛋白质污染,你可能已经开始使用过量的样本,增加不完全溶解的风险。如果萃取物的260/230比率较差,则通常是由于结扎后残留盐或洗涤不当。确保使用最高质量的乙醇来准备清洗缓冲液,如果问题继续,执行一个额外的清洗步骤。

杂质

环境样品尤其容易产生杂质,因为在提取过程中腐殖质容易溶解。在提取过程中,这些物质的行为与DNA相似,很难从硅胶柱中去除。对于容易产生杂质的样品,专业技术存在以在柱结合之前去除干扰蛋白质和腐殖质。

退化

这对RNA的更大问题而不是DNA提取,并且可以找到关于RNA的具体建议在这里。如果样品是用无rnase的水洗脱,那么由于样品存储不当或裂解效率低,经常会发生RNA降解。对于DNA提取,如果PCR是理想的应用,降解不是一个大问题,但如果你希望完整的高分子量DNA用于长范围测序应用,你应该确保在裂解你的样本时不要太苛刻!

PCR清理特殊考虑因素

PCR清理本身并不是一种DNA提取技术,但在这里值得一提。通常,PCR产物通过在每个PCR反应中加入3-5体积的盐来清洗,然后通过旋转柱将混合物离心。尽管不成功的PCR常常导致清理失败,但在柱绑定后节省您的流动是值得的。如果一个强聚合酶链反应的条带没能通过色谱柱,很有可能它就在流通区。你总可以拯救它,再清理一次。

发出并充满信心地进行RNA和DNA提取

作为科学家,我们经常希望能够在不求助外部帮助的情况下解决问题。这篇文章应该澄清一些科学围绕硅自旋过滤器技术,让您在任何时间排除故障。如果所有这些都失败了,那么在你寻求技术支持的时候,你就已经完成了你的功课,而且你应该能更快地达成一个解决方案,即使那是一个免费的替代DNA提取试剂盒!

最初于2010年出版,2017年重新出版。

DNA提取

15个评论

  1. Vinkesh 2019年1月21日上午10:32

    非常有帮助

  2. 亚伯 2017年12月1日上午11:25

    你好,

    我不小心把我的基因组DNA稀释得太低了。现在我想恢复更集中的状态。基因组DNA柱能帮我吗?

  3. Ramya Srinivasa 2017年7月29日上午5:18

    堆积在DNA /RNA中的cy染料在乙醇沉淀后仍然存在并出现在尿素PAGE上的可能性有多大?

  4. 这个镇 2017年6月19日下午1:07

    我想从反应中纯化DNA,以测试所有蛋白质的DNA。这意味着我净化的DNA将在一个股线上有一些缺口,但不是另一条痕迹。这些切口产品可以为1.5kb至0.7kb。如果我使用杂质盐进行纯化,这些切屑产品会与DNA一起洗脱吗?

  5. 布鲁斯•特纳 2017年4月17日晚上8:11

    我一直在使用含有追踪染料和增密度剂(大概是菲克尔)的2X PCR“主混合剂”,这样PCR产物的样本就可以直接装入凝胶中。这是非常方便的,特别是对多个样本的调查和培训学生。我假设我可以通过使用标准试剂盒(例如,Zymo DCC-25)从这些反应中纯化扩增子(大约2kb),并在将溶液放到柱上之前添加通常的5体积的“结合缓冲液”。令我懊恼的是,我注意到我没有从我的清理专栏中获得预期的收益;事实上,有时我的产量会下降20%左右(使用凝胶密度测量法来测量DNA数量)。有人有类似的经历吗?有什么原因为什么染料或密度剂应该干扰结合到二氧化硅柱?我应该添加更多(或更少)绑定缓冲区吗?

  6. 劳拉 2017年2月14日晚上12:27

    我用真空泵进行了DNA纯化,但在实验结束时我没有洗脱量,什么都没有!唯一不正常的是在仪式上的技术问题,所以我不得不放大每一步。反应时间对DNA纯化有很大影响吗?

    • 阿曼达·韦尔奇博士 2017年2月15日在下午4:01

      有没有可能你的专栏写得太多了?这会导致你损失收益。

      此外,洗脱步骤应该*不使用真空泵进行(我确定你知道,但这是为了其他任何人阅读)。

  7. 乔迪 2017年1月11日下午1:20

    你好,
    我们观察到,用DNA试剂盒清洁后,PCR产品在琼脂糖凝胶中在琼脂糖凝胶中略微下降。你随时观察到这样的东西吗?
    非常感谢。

  8. 默罕默德 2016年7月19日晚上7:41

    在Nanodrop中,通过使用试剂盒进行粪便DNA提取的试剂盒浓度低,当我测量凝胶中含有DNA的样品并非所有样品都显示带!!!
    什么原因?

  9. Jacobus de Waard 2016年4月29日下午3:56

    有些公司为不同目的提供不同的核酸隔离柱。看。http://www.fairbiotech.com/shopping_show-2a14753aaa.html
    在这个网页上他们提供基因组DNA分离柱,总RNA纯化柱,病毒DNA/RNA纯化柱,DNA纯化柱和RNA纯化柱。
    有人能解释一下这两列有什么区别吗?也许不同的硅溶胶涂上了其他类型的阳离子基团。

    • 海琳 2018年7月20日5点28分

      我也有同样的问题。有人知道答案吗?基因组DNA自旋柱和质粒DNA自旋柱有什么区别吗?用哪一种方法从质粒中纯化pcr产物?

  10. Tiffany Taylor. 2015年12月4日上午7:11

    在干旋转效率不高的情况下,如何去除洗脱前或洗脱后备品中的残留乙醇,您还有其他建议吗?

    • Alicai莫拉莱斯 2016年2月16日在下午5:20

      一些方案留下一个“干燥期”,在乙醇旋转3-5分钟后,关闭盖子蒸发乙醇在56C孵化柱。这样做很好。

    • 盟友 2016年8月4日在下午1:53

      我见过的大多数试剂盒都是离心2分钟,有时候这还不够好。为了安全起见,我以13000 RPM的速度旋转了5-10分钟。我认为这也取决于所用的硅质膜。“微洗脱”(即5-20µL洗脱)色谱柱通常有较厚的膜,似乎需要更长的时间来将乙醇旋转出来。

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