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核酸提取试剂盒工作的完整指南

黑盒子表示核酸提取试剂盒

在Bibob综合博彩tesize Bio,我们分享了很多RNA的故障排除技巧基因组DNA提取因为几乎我们在分子生物学中做的每一件事都需要核酸分离作为第一步。bob网站app如今,大多数实验室都使用基于自旋柱技术的商业核酸提取试剂盒。

自旋柱包含一种选择性结合DNA(或RNA)的硅树脂,取决于盐条件和其他受提取方法影响的因素。其结果是为克隆提供了高质量的材料,远程测序,读测序,以列举一些潜在的应用。

基因组DNA提取试剂盒通常比传统方法更容易和更快使用,不需要重要的专业知识。但是,缺点是,如果您不了解工具包的黑盒子中有什么,则可能很难进行故障排除!

在这篇文章中,我们将一步一步的介绍核酸提取试剂盒的原理。我们还将看看一些常见的问题与二氧化硅柱,您可以克服一些简单的技巧!

核酸提取试剂盒的一步一步指南

第一步:细胞裂解

裂解公式可能会根据你是想提取DNA还是RNA而有所不同。一般来说,裂解缓冲液含有高浓度的向潮盐。Chaotropes在核酸提取中有两个重要作用:

  1. 它们使氢键、范德华力和疏水相互作用不稳定,导致蛋白质的不稳定,包括核酸酶;
  2. 它们破坏了核酸与水的结合,从而为它们转移到二氧化硅提供了最佳条件。

朝向盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

除了反相外,洗涤剂也经常出现在裂解缓冲液中,以帮助蛋白质溶解和细胞裂解。

根据样品类型的不同,酶也可能在这里出现。广谱丝氨酸蛋白酶蛋白酶K是非常有效的消化蛋白质远离核酸制剂。蛋白酶K在蛋白质变性条件下(即变性裂解缓冲液)效果最好。另一种常见的酶溶菌酶在变性条件下不起作用,在加入变性盐之前,溶菌酶的活性最高。

请记住,分离质粒的裂解与提取RNA或基因组DNA的裂解有很大不同,因为质粒必须首先从基因组DNA中分离出来。chaotropes的加入将同时释放所有类型的DNA,从而失去区分小环状DNA和高分子量染色体的能力。因此,在质粒制备中,直到细胞裂解后才加入chaotropes。想要更多的阅读,请查看这些伟大的文章碱性溶菌作用质粒和基因组DNA提取

第二步:纯化-将核酸结合到色谱柱上

如上所述,向潮盐是裂解和结合柱的关键。乙醇(有时是异丙醇)的加入将进一步增强和影响核酸与二氧化硅的结合。

注意,使用的乙醇的百分比和体积很重要。过多的乙醇会降低降解物质和小物种,从而影响在260 nm处的吸光度(A260阅读)。另一方面,乙醇过少可能会阻碍盐从膜上的清洗。

幸运的是,你正在使用的核酸提取试剂盒,乙醇的添加量是最优的。然而,如果你怀疑退化的DNA正在膨胀你的A260读数,你可以考虑重新优化乙醇浓度。

另一个有用的建议是保存流动和沉淀它,看看你是否能找到你丢失的材料。如果您使用含sds的洗涤剂进行裂解,请尝试使用NaCl作为沉淀剂,以避免洗涤剂污染您的核酸。

第三步:洗

通过二氧化硅膜离心后,所需的核酸应与色谱柱结合,蛋白质和多糖等杂质应在流动中。然而,膜将包含蛋白质和盐残基。在这一点上,植物样本可能含有多糖和色素,而血液样本的细胞膜可能是略微棕色或黄色的。洗涤步骤去除这些杂质。

通常有两个洗涤步骤,尽管这取决于样品类型。第一次清洗通常包括低浓度的混沌盐,以去除残留的蛋白质和色素。然后用乙醇清洗去除盐分。如果样品开始时不含大量蛋白质(例如,质粒准备或PCR清理),用乙醇清洗就足够了。

去除混沌盐是获得高收率和纯度的关键。有些套件实际上推荐两种乙醇洗涤。残留的盐会阻碍核酸的洗脱,导致产量差,A值高230读数,因此A较低260/230比率。

第四步:干燥旋转无乙醇DNA和RNA

大多数方案包括洗涤后的离心步骤,以干燥残留的乙醇柱,这一步是必不可少的清洁洗脱液。随后向膜中加入10 mM的Tris缓冲液或水,将核酸水合物化,从而将其从膜中洗脱出来。此时膜上残留的乙醇将阻止充分的水合作用和核酸的洗脱。

你在分光光度计上看不到乙醇,但一个很好的酒精存在指示剂是样品不会沉到琼脂糖凝胶的孔里,即使有装载染料。乙醇污染的另一个指标是样品没有在-20°C冻结。

第五步:最后的边界-洗脱

DNA提取协议的最后一步是从二氧化硅中释放出纯DNA或RNA。

对于DNA提取,通常使用pH 8-9的10mm Tris。DNA在稍碱性的pH值下更稳定,在缓冲液中溶解的速度比水快。即使对于DNA颗粒也是如此。水的pH值往往较低,为4-5,高分子量DNA可能不会在用于洗脱的短时间内完全水合。对于最大限度的DNA洗脱,让缓冲液在膜上停留几分钟,然后离心。对于需要完整高分子量DNA的应用,如长程测序和长读测序,洗脱缓冲液是最好的选择。

然而,RNA可以忍受微酸性的pH值,并容易溶于水,使之成为首选的稀释剂。

核酸提取试剂盒会出什么问题?

低收益率

如果你的收益低于预期,有很多因素需要考虑。这通常是一个裂解问题,不完全裂解是低产量的主要原因。不正确的绑定条件是另一种可能。确保使用新鲜的高质量乙醇(100%,200 proof)稀释缓冲液和绑定步骤。低质量的乙醇或旧库存可能占用了水,扭曲了实际的工作浓度。记住,如果你制作的洗涤缓冲液不正确,你可能会冲走提取的DNA或RNA!

低纯度

如果萃取物被蛋白质污染了,你可能已经开始了过量的样品,增加了不完全溶解的风险。如果提取物中A较差260/230比例问题通常是捆绑后残留的盐或洗涤不当。务必使用最高质量的乙醇来准备洗涤缓冲液,如果问题继续存在,则执行额外的洗涤步骤。

杂质

环境样品特别容易产生杂质,因为腐殖质在提取过程中容易溶解。在提取过程中,这些物质的行为通常与DNA相似,很难从硅胶柱中去除。对于容易有杂质的样品,有专门的技术可以在柱结合前去除干扰蛋白和腐殖质

退化

这是RNA比DNA提取更重要的问题你可以找到具体的建议排除RNA提取的问题.RNA降解通常是由于样品储存不当或裂解效率低下,当然,假设样品是用不含RNA的水洗脱的。对于DNA提取,如果PCR是理想的应用,降解不是一个大问题,但如果你希望完整的高分子量DNA用于长程测序应用,你应该确保在溶解你的样品时不要太苛刻!

PCR清理的特别注意事项

PCR清除本身并不是一种DNA提取技术,但在这里值得一提。通常,PCR产物的清理是通过每体积PCR反应添加3-5体积的盐,然后通过旋转柱离心混合物。虽然失败的清理通常是由不成功的PCR引起的,但值得在柱绑定后保存您的流程。如果一个强的PCR带没有通过色谱柱,那么它很有可能在流动通道中。你总是可以拯救它,并再次清理它。

自信地使用你的核酸提取试剂盒

作为科学家,我们经常希望能够在不寻求外界帮助的情况下解决问题。这篇文章应该阐明一些科学围绕硅自旋过滤技术在许多核酸提取试剂盒,让您在任何时候排除故障。如果以上所有方法都失败了,那么在你寻求技术支持的时候,你就已经做足了功课,而且你应该能更快地达成解决方案,即使那是一个免费的DNA提取试剂盒!

您对核酸提取试剂盒的工作有什么意见和问题吗?请在下方留言。

最初发表于2010年6月28日。2021年5月评论并再版。

黑盒子表示核酸提取试剂盒
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15个评论

  1. Vinkesh 2019年1月21日上午10点32分

    非常有用的



  2. 亚伯 2017年12月1日上午11点25分

    你好,

    我不小心把我的基因组DNA稀释得太低了。现在我想恢复更集中的状态。基因组DNA列能帮我吗?



  3. Ramya Srinivasa 2017年7月29日凌晨5点18分

    堆积在DNA /RNA中的cy染料在乙醇沉淀后仍然存在并出现在尿素PAGE上的可能性是什么?



  4. 这个镇 2017年6月19日下午1:07

    我想从一个反应中净化DNA,以测试我所有的蛋白质在DNA上的缺口。这意味着我正在净化的DNA会在一条链上有一些刻痕,而在另一条上没有。这些被刻痕的产品可能从1.5Kb到0.7Kb不等。如果我用潮变盐进行纯化,这些被刻痕的产物会和DNA一起被洗脱吗?



  5. 布鲁斯•特纳 2017年4月17日晚上8点11分

    我一直在使用2X PCR“主混合剂”,它包含跟踪染料和增密度剂(大概是Ficoll),这样PCR产物的样本就可以直接装载到凝胶上。这是非常方便的,特别是对多个样本的调查和培训学生。我假设我可以通过使用标准试剂盒(例如,Zymo DCC-25)从这些反应中纯化扩增子(大约2 KB),并在将溶液放在色谱柱上之前添加通常5体积的“结合缓冲液”。令我懊恼的是,我注意到,我的清理专栏并没有获得预期的收益;事实上,有时我的产量会下降20%左右(用凝胶密度仪测量DNA含量)。有人有过类似的经历吗?是否有任何原因导致染料或密度剂会干扰与硅胶柱的结合?我应该添加更多(或更少)绑定缓冲区吗?



  6. 劳拉 2017年2月14日下午12:27

    我用真空泵纯化了DNA,但在实验结束时,我没有洗脱体积,什么都没有!在礼仪过程中唯一不正常的是礼仪的技术问题,所以我不得不扩大每一步。反应时间对DNA纯化有很大影响吗?



    • 阿曼达·韦尔奇博士 2017年2月15日下午4:01

      有没有可能你的专栏超载了?这会导致你失去收益。

      此外,洗脱步骤不应该* *使用真空泵进行(我相信你知道,但这是为任何人阅读)。



  7. 乔迪 2017年1月11日下午1:20

    你好,
    我们观察到,在用DNA试剂盒清洗后,PCR产物在琼脂糖凝胶中运行得稍微低一些。你有观察到类似的情况吗?
    非常感谢。



  8. 默罕默德 2016年7月19日晚上7:41

    在nanodrop中,我通过使用粪便DNA提取试剂盒得到低浓度的DNA,当我测量凝胶中含有DNA的样品时,不是所有的样品都显示出条带!!
    什么原因?



  9. Jacobus de Waard 2016年4月29日下午3:56

    一些公司为不同的目的提供不同的核酸分离柱。参见示例。http://www.fairbiotech.com/shopping_show-2a14753aaa.html
    在这个网页上,他们提供基因组DNA分离柱,总RNA纯化柱,病毒DNA/RNA纯化柱,DNA纯化柱和RNA纯化柱。
    有人能解释一下这两列有什么不同吗?也许不同的硅珠涂有其他类型的阳离子基团?



    • 海琳 2018年7月20日凌晨5点28分

      我也有同样的问题。有人知道答案吗?基因组DNA自旋柱和质粒DNA自旋柱有什么区别吗?用什么方法从质粒中纯化聚合酶链反应产物?



  10. 蒂芙尼泰勒 2015年12月4日7点11分

    当干旋转是低效的,你有任何其他建议如何去除在洗前或洗后的准备中残留的乙醇?



    • Alicai莫拉莱斯 2016年2月16日下午5点20分

      一些方案通过在56℃下旋转乙醇3-5分钟,打开盖子蒸发乙醇,然后在柱中培养,留下一个“干燥期”。这样很有效。



    • 盟友 2016年8月4日下午1:53

      我看过的大多数套件协议说离心2分钟,这有时不够好。为了安全起见,我以13000转/分旋转5-10分钟。我认为这也取决于使用的二氧化硅膜。“微洗脱”(即5-20 μ L洗脱)色谱柱通常有更厚的膜,似乎需要更长的时间来旋转乙醇出来。



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