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如何在质粒制备中识别超级石油,缺口和圆圈

如何在质粒制备中识别超级石油,缺口和圆圈

对于第一次使用DNA质粒制备方法,我最喜欢与学生有关的事情之一是使它们运行含有2个样品的琼脂糖凝胶:未被限制酶线性化的未孵化质粒DNA和质粒DNA。我喜欢让他们尝试并弄清楚未来质粒DNA的绷带模式(为什么你看到2-3频段?)与线性化DNA的单个带(以及为什么所有频段在线化时转换为1个带?)。

我喜欢这项运动,因为了解他们对凝胶的形式需要了解DNA的性质。在本文中,我将专注于在凝胶上观察到的四种最常见的质粒DNA,以及如何识别它们。在我的下一篇文章中,我将介绍如何增加所需的超级硅基物种的恢复。

一个分子,许多形式

当分离质粒DNA并在琼脂糖凝胶上运行时,您可以观察到2,3甚至4个或更多条带。希望你的大多数孤立的DNA将是超级硅酸的DNA,但其他形式也可以裁剪。这些形式将如何显示在琼脂糖凝胶上(在相对迁移速度方面)如下图所示。

质粒制备精品

以下是每个表格来自的地方:

超级硅酸质粒

SupercoIled DNA是发现的本地确认体内并在额外的扭曲被引入双螺旋线时发生。人们经常将DNA的形式与橡皮带或电话线进行比较(我知道一些你必须记得有绳索的手机!)。如果您通过扭曲橡皮筋或电话线,则线圈堆叠在另一个引入张力。在质粒制备的情况下,由于质粒的末端连接在一起,因此不能释放这种超螺栓。由于其构象,超级硅酸可达DNA迁移得比在琼脂糖凝胶中预测。当分离质粒DNA时,超级硅酸钠是所需的物种。

缺口,轻松的圆形质粒

复制机械不容易进入超级硅形式中的DNA。在复制期间,细胞拓扑异构酶在DNA螺旋中的一条链并松弛过滤张力,从而允许聚合酶进入DNA。使用橡皮筋比而言,切口圆DNA是没有任何曲线的橡皮筋。这种大的软盘圆形是琼脂糖凝胶中最慢的迁移形式。

线性质粒

当在同一位置的两个股线中切割DNA螺旋时发生线性化DNA。线性DNA通常迁移在切口圆圈和超填充形式之间。然而,它还可以将与切口圆的距离迁移相同的距离 - 它迁移,如通过DNA的长度预测(与MW标记相比)。您可以通过将未染色质粒DNA与使用限制酶线性化的质粒样品进行比较来识别琼脂糖凝胶上的线性DNA形式。如果当您希望超级筛选时获得线性DNA(例如,在质粒制备后),它是由于净化过程中的核酸酶污染或苛刻治疗。

圆形,单链质粒

在碱性裂解质粒制备过程中,质粒变性,因为氢键被碱性条件破坏。但是共价闭合的圆形股线保持完整和拓扑限制,当pH返回中性时,重新形成氢键改性,并重新形成超硅键改性。但是,如果碱性裂解步骤过于苛刻(例如,孵育太长)DNA可以永久地变性并为您提供无用的单链闭合圆圈,这些圆圈在凝胶中以前迁移的所有其他形式的质粒。

虽然DNA质粒制备可以返回多种形式的DNA,但只有一种您想要成功的克隆和转染:超级硅化。确保你知道如何增加你的恢复优质的超级硅酸DNA

图像信用:the莫伊

13评论

  1. ishita sarkar. 2019年7月25日在下午4:58

    oc DNA是否比CCC DNA更小的尺寸速度更快?什么是频繁的乐队更强烈的荧光的原因是远远超过其他乐队?

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