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实验室基础:碱性裂解如何工作

持有碱性pH测试条的科学家代表实验室中的碱性裂解

Birnboim和Doly于1979年首先描述了碱性裂解,并进行了一些修改,是从那以后从细菌中提取质粒DNA的首选方法。[1]描述碱性裂解的最简单方法是通过该过程并解释每个步骤,所以这里进行。

碱性裂解的分步指南

步骤1:细胞生长和收获

您从带有质粒的细菌细胞培养物的生长开始。当实现足够的生长时,细胞会通过离心颗粒,以将其从生长培养基中取出。

步骤2:重悬于

然后将沉淀重悬于包含Tris,EDTA,葡萄糖和RNaseA的溶液中(通常称为溶液1或类似的溶液1)。

二价阳离子(mg2+,CA2+)对于DNase活性和细菌细胞壁的完整性至关重要。

EDTA在溶液中螯合二价阳离子,以防止DNase损坏质粒,并有助于破坏细胞壁。

葡萄糖保持渗透压,因此细胞不会破裂,并包括RNase A以溶解细胞时降解细胞RNA。

步骤3:碱性裂解

裂解缓冲液(又名溶液2)含有氢氧化钠(NaOH)和硫酸钠(Lauryl)硫酸钠(SDS)。

SDS溶解细胞膜。

NaOH有助于分解细胞壁,但更重要的是,它破坏了DNA碱基之间的氢键,将细胞中的双链DNA(dsDNA)转化,包括基因组DNA(GDNA)和您的质粒,将其转化为单个单粒质粒。滞留的DNA(ssDNA)。

该过程称为变性,是该过程的中心部分,这就是为什么称为碱性裂解的原因。

SDS还剥夺了细胞中的大多数蛋白质,这有助于稍后在过程中将蛋白质与质粒分离。

在此步骤中,重要的是要确保重新悬浮和裂解缓冲区混杂在一起,尽管不太有力(见下文)。查看我的相关文章基因克隆矢量制备的5个技巧有关更多信息和提示。另外,请记住,SDS和NAOH非常讨厌,因此建议在执行碱性裂解时戴上手套和眼睛保护。

步骤4:中和

乙酸钾的添加(溶液3)降低了混合物的碱度。在这些条件下,可以重新建立单链DNA碱基之间的氢键,因此ssDNA可以重新添加到dsDNA。这是选择性部分。

虽然小圆形质粒DNA很容易重新定性,但不可能正确地退火那些巨大的gDNA拉伸。这就是为什么在裂解步骤中保持温和的原因,因为剧烈的混合或涡旋会剪切GDNA产生较短的伸展能够重新纯净并污染您的质粒准备。

虽然双链质粒可以轻松溶于溶液中,但单链基因组DNA,SDS,而变性的细胞蛋白通过疏水相互作用将其粘在一起,形成白色沉淀物。通过离心,可以轻松地将沉淀物与质粒DNA溶液分离。

步骤5:清洁和集中

现在,您的质粒DNA已与大多数细胞碎屑分离,但在含有大量盐,EDTA,RNase和残留的细胞蛋白和碎屑的溶液中,因此对于下游应用并不多。下一步是清理溶液并浓缩质粒DNA。

有几种方法可以做到这一点,包括苯酚/氯仿提取,然后是乙醇沉淀和基于亲和力色谱的方法,使用辅助在盐或pH的某些条件下优先与质粒DNA结合的支持,但在其他条件下释放出来。最常见的方法在文章中详细介绍了清理DNA样品的5种方法

那么,您多久将一次碱性裂解作为质粒准备?在评论部分中,让我们知道您使用的任何很酷的技巧和技巧,以获得更好,更快的结果!

参考

  1. Birnboim H.C.和Doly J.快速碱性提取程序,用于筛选重组质粒DNA。核酸研究,1979年;7(6):1513–23。

最初于2014年10月8日发布。审查并重新发布了2021年6月。

73条评论

  1. 罗斯福·安雅瓦(Roosevelt Anyanwu) 2018年9月28日晚上7:38

    我可能是错的,但是这里的葡萄糖似乎是可选的,因为随后需要裂解细胞。但是,在溶菌酶方法中,我们绝对需要防止细胞破裂。



    • 残酷的 2019年6月30日晚上8:20

      由于最终目的是打破细胞,因此使用葡萄糖维持同位素的逻辑没有逻辑。但是,葡萄糖起重要作用。添加葡萄糖的目的是将溶液的pH值保持在12至12.5之间。葡萄糖的PKA为12.3。在此pH值下,基因组DNA代理和质粒DNA保持完整。
      参考。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc342324/?page=2



  2. 苏曼 2017年5月3日下午2:04

    你好
    有人可以在质粒隔离过程中向我推荐有关添加的og te-rnase。我错误地增加了水。我现在可以做什么才能获得DNA。



    • 萨加尔 2019年1月10日上午9:35

      您的质粒仍然溶于水中,所以不用担心,您的质粒在水中



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