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基础知识:碱解是如何工作的

基础知识:碱解是如何工作的

碱性裂解最早由Birnboim和Doly在1979年描述(核酸RES。7,1513-1523),经过一些改进,一直是从细菌中提取质粒DNA的首选方法。最简单的方法来描述如何碱裂解工作是通过整个过程和解释每一步,所以这里。

1.细胞生长与收获

这个过程从携带你的质粒的细菌细胞培养物的生长开始。当细胞生长充足时,将细胞离心制成颗粒,从培养基中去除。

2.Re-suspension

小球然后在含有Tris, EDTA,葡萄糖和RNase a的溶液中重新悬浮(通常称为溶液I,或试剂盒中的类似溶液)。二价阳离子(Mg2+, Ca2+)对DNase活性和细菌细胞壁的完整性是必不可少的。EDTA螯合溶液中的二价阳离子,防止dna酶破坏质粒,也有助于破坏细胞壁的稳定。葡萄糖维持着渗透压,所以细胞不会破裂,当细胞被裂解时,RNase A被包含来降解细胞RNA。

3.溶菌作用

裂解缓冲液(AKA溶液2)含有氢氧化钠(NaOH)和洗涤剂十二烷基(月桂基)硫酸钠(SDS)。SDS在那里溶解细胞膜。NaOH有助于分解细胞壁,但更重要的是,它破坏了DNA碱基之间的氢键,将双链DNA(DSDNA)转化在细胞中,包括基因组DNA(GDNA)和您的质粒,对单链DNA(SSDNA)。该过程称为变性,是该过程的中央部分,这就是为什么它被称为碱性裂解。SDS还为细胞中的大部分蛋白质变性,这有助于在此后在该方法中与质粒分离蛋白质。

在这一步骤中,确保再悬液和裂解缓冲液充分混合是很重要的,尽管不是太剧烈(见下文)。看看我的文章基因克隆载体制备的5个要点有关更多信息和提示。还请记住,SDS和NaOH非常讨厌,所以建议在进行碱性裂解时佩戴手套和眼睛保护。

4.中和

加入醋酸钾(溶液3)可以降低混合物的碱度。在这样的条件下,单链DNA的碱基之间的氢键可以重新建立,因此ssDNA可以重新成为dsDNA。这是选择性的部分。虽然小的环状质粒DNA很容易重新自然,但不可能正确地退火那些巨大的gDNA延伸。这就是为什么在裂解过程中要温和的原因,因为剧烈的混合或涡流会剪切gDNA产生更短的延伸能够重新退火并污染质粒准备。

双链质粒在溶液中容易溶解,而单链基因组DNA、SDS和变性细胞蛋白通过疏水作用粘连在一起形成白色沉淀。通过离心分离,可以很容易地将沉淀从质粒DNA溶液中分离出来。

5.清洁和浓度

现在,您的质粒DNA已与大多数细胞碎片分离,但在含有大量盐,EDTA,RNase和残留细胞蛋白和碎片的溶液中,因此对下游应用并不多。下一步是清理溶液并浓缩质粒DNA。

存在几种方法可以做到包括苯酚/氯仿提取,然后使用乙醇沉淀和亲和力的色谱 - 基于亲和力的方法,所述载体在某些盐或pH条件下优先与质粒DNA结合,但在其他条件下释放它。我的文章中详细说明最常见的方法5种方法清理DNA样品

73评论

  1. 罗斯福Anyanwu 2018年9月28日晚上7:38

    我可能是错的,但这里葡萄糖似乎是可选的,因为需要随后裂开细胞。然而,在溶菌酶方法中,我们肯定需要预防细胞爆裂。

    • 残酷的 2019年6月30日晚上8:20

      由于最终目的是破坏细胞,因此没有逻辑使用葡萄糖来保持等渗性。然而,葡萄糖起着重要的作用。加入葡萄糖的目的是使溶液的pH值保持在12到12.5之间。葡萄糖的pKa是12。3。在这个pH值下,基因组DNA变性和质粒DNA保持完整。
      Ref。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/?page=2

  2. suman 2017年5月3日下午2:04

    你好
    谁能给我建议在质粒分离过程中加入TE- Rnase。我错加了水。我现在能做什么来获得DNA。

    • Sagar 2019年1月10日上午9:35

      你的质粒还溶解在水里,所以别担心,你的质粒就在水里

  3. 星号 2017年1月31日晚上9:18

    PLZ告诉我,从细菌细胞中的DNA提取的哪种方法主要使用n成功

    • aashish哈斯。 2017年6月16日晚上7:37

      我们有一种方法

  4. Vijay Kumar. 2015年12月4日上午7:13

    是否氢氧化钠用于基因组DNA的分离?在哪个阶段,NaOH用于从细菌中分离基因组DNA ?请帮帮我。

    • 艾哈迈德 2015年12月11日在上午3:29

      实际上,我们普遍看待材料

      EDTA通过连接保护细胞结构所需的Mg ++离子和抑制细胞的DNA降解酶来破坏细胞结构。

      * SDS裂解除去脂质分子并破坏细胞膜中断的结构。

      *苯酚-氯仿,porém,使其远离沉积的DNA。

      *纯乙醇提供环境中的H2O分子与DNA塌陷竞争。

      *乙醇70%,Na +允许一价阳离子和盐溶解远离环境。

      • 艾哈迈德 2015年12月12日下午3:32

        一个补充,
        NaOH的目的,连接DNA的柔性结构。(pH的效果)

  5. 纳西尔·阿里 2015年10月21日在下午6:14

    嗨尼克,
    我有个问题 ??我们可以使用基因组DNA的碱性提取方法吗?或该方法特异于质粒DNA。

    问候
    纳西尔

    • 戴安娜 2019年7月1日上午2:32

      看看HotShot方法(我们用它从老鼠的尾巴或耳鸣进行基因分型)。这是杰克斯实验室的规定众所周知,也查查冷泉港。我想第一次出版是在80年代。
      基本上,在碱性裂解缓冲液中加热样品(NaOH和EDTA, pH约为10),加热30分钟至2小时,用Tris HCl缓冲液中和(pH约为5),然后用1-2ul进行PCR。

      • 戴安娜 2019年7月1日凌晨2:33

        热量为95摄氏度

  6. 理查德杨 2015年7月16日晚上7:51

    我用良好的成功使用碱性裂解方法进行质粒净化多次。我想知道RNA在质粒的EtOH沉淀后携带。我一直在寻找并没有找到关于这个问题的证据的任何艰难讨论。我注意到,在协议内,在添加NaOH / SDS之前建议添加RNase A.但是,我没有看到RNASE A如何在这一步上不被变化。对我来说,它可以添加RNaseA + TE缓冲+细胞+细胞,它们将与RNase A粘合,然后降解RNA。孵育期后,可以添加NaOH / SDS并进行协议。但是,回到RNA问题。有谁知道RNA是否随着ETOH降水进行携带?

  7. Agnese Kocere. 2015年6月2日晚上11:06

    你好!我对以下情况非常困惑;葡萄糖保持渗透压,因此细胞不会爆裂

    为什么如果你想怀疑他们,为什么试着避免细胞爆裂?

    有人能解释一下吗,也许能更好地解释一下为什么我们要添加葡萄糖?

    • Shishir Pandey 2017年2月5日在上午8:11

      添加葡萄糖,因为它用作pH调节剂。

    • 残酷的 2019年6月30日晚上8:21

      由于最终目的是破坏细胞,因此没有逻辑使用葡萄糖来保持等渗性。然而,葡萄糖起着重要的作用。加入葡萄糖的目的是使溶液的pH值保持在12到12.5之间。葡萄糖的pKa是12。3。在这个pH值下,基因组DNA变性和质粒DNA保持完整。
      Ref。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/?page=2

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