跳到内容

实验室基础:碱性裂泥裂解如何工作

在实验室中,科学家手持碱性pH测试条,代表碱溶解

碱性裂解最早由Birnboim和Doly在1979年提出,经过一些修改,从那时起就成为从细菌中提取质粒DNA的首选方法最简单的方法来描述碱性裂解是如何工作的是通过程序和解释每个步骤,所以这里开始。

碱性裂解的逐步指南

第一步:细胞生长和收获

你从培养含有质粒的细菌细胞开始。当达到足够的生长时,用离心法将细胞成球,将它们从生长培养基中除去。

第二步:再悬浮

然后将颗粒重悬于含有Tris,EDTA,葡萄糖和RNase A的溶液中(通常称为溶液1,或类似物中的溶液1,或类似物)。

二价阳离子(毫克2+,加利福尼亚州2+)对于DNase活性和细菌细胞壁的完整性至关重要。

EDTA在溶液中螯合二价阳离子,防止DNAses损害质粒,并且还通过稳定细胞壁来帮助。

葡萄糖保持渗透压,因此当细胞裂解时,将细胞不会突发并抑制rNasea以降解细胞RNA。

第三步:碱性裂解

裂解缓冲液(又称溶液2)含有氢氧化钠(NaOH)和洗涤剂十二烷基(十二烷基)硫酸钠(SDS)。

SDS可溶解细胞膜。

氢氧化钠有助于破坏细胞壁,但更重要的是,它破坏了DNA碱基之间的氢键,将细胞中的双链DNA (dsDNA),包括基因组DNA (gDNA)和质粒,转化为单链DNA (ssDNA)。

这个过程被称为变性,是变性过程的核心部分,这就是为什么它被称为碱性溶解。

SDS还使细胞中的大多数蛋白质变性,这有助于稍后从质粒中分离蛋白质。

在这一步骤中,重要的是要确保再悬浮和裂解缓冲液混合良好,尽管不要太剧烈(见下文)。查看我的相关文章5关于基因克隆的载体制剂的提示获取更多信息和技巧。另外,记住SDS和NaOH是非常讨厌的,所以建议在进行碱解时戴上手套和眼睛保护。

步骤4:中和

醋酸钾(溶液3)的加入降低了混合物的碱度。在这些条件下,单链DNA的碱基之间的氢键可以重新建立,所以ssDNA可以重新自然为dsDNA。这是选择性的部分。

虽然小圆形质粒DNA很容易重新自然,但是不可能适当地退火那些巨大的GDNA延伸。这就是为什么在裂解步骤期间温和很重要,因为剧烈的混合或漩涡将剪切的GDNA产生较短的拉伸可以重新退火,污染你的质粒准备。

虽然双链质粒可以容易地溶解在溶液中,单链基因组DNA,SDS和变性细胞蛋白通过疏水相互作用,形成白色沉淀物。通过离心可以容易地将沉淀物与质粒DNA溶液分离。

步骤5:清洁和浓缩

现在,您的质粒DNA已与大多数细胞碎片分离,但在含有大量盐,EDTA,RNase和残留细胞蛋白和碎片的溶液中,因此对下游应用的使用并不多。下一步是清理溶液并浓缩质粒DNA。

有几种方法可以做到这一点,包括苯酚/氯仿提取,然后是乙醇沉淀和基于亲和层析的方法,使用的支持物在盐或pH的某些条件下优先与质粒DNA结合,但在其他条件下释放它。最常用的方法在这篇文章中有详细介绍5种方法清理DNA样品

那么,你多久使用一次碱性裂解剂量的质粒制剂?让我们知道,在评论部分中,您使用的任何很酷的提示和技巧,以获得更好,更快的结果!

工具书类

  1. Birnboim H.C.和愚蠢的J.一种筛选重组质粒DNA的快速碱性提取方法。核酸的研究,1979年;7.(6):1513-23。

最初发布于2014年10月8日。2021年6月8日审查和重新发布。

在实验室中,科学家手持碱性pH测试条,代表碱溶解

73评论

  1. 罗斯福安曼武 2018年9月28日在下午7:38

    我可能是错的,但这里葡萄糖似乎是可选的,因为需要随后裂开细胞。然而,在溶菌酶方法中,我们肯定需要预防细胞爆裂。



    • 残酷的 2019年6月30日晚8点20分

      由于最终目的是破坏细胞,因此没有逻辑使用葡萄糖来维持异常。然而,葡萄糖起着重要作用。添加葡萄糖的目的是将溶液的pH保持在12至12.5之间。葡萄糖具有12.3的pka。在该pH下,基因组DNA Dnatures和质粒DNA保持完整。
      参考。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/?page=2



  2. suman 2017年5月3日下午2:04

    你好
    有人可以建议我在质粒隔离过程中添加og te-rnase。我错误地添加了水。我现在能做什么来获得DNA。



    • Sagar. 2019年1月10日上午9点35分

      你的质粒仍然溶解在水里,所以不要担心,你的质粒是在水里的



  3. 星号 2017年1月31日晚上9:18

    PLZ告诉我,从细菌细胞中的DNA提取的哪种方法主要使用n成功



    • 艾萨克斯赛德干塔 2017年6月16日晚上7:37

      我们有一种方法



  4. 维贾伊·库马尔 2015年12月4日上午7:13

    NaOH是否用于基因组DNA分离?在哪个阶段,NaOH用于来自细菌的基因组DNA分离?请帮帮我。



    • 艾哈迈德 2015年12月11日凌晨3点29分

      实际上,我们看一般的材料

      EDTA通过连接保护细胞结构和抑制细胞的DNA劣化酶所需的Mg ++离子来破坏细胞结构。

      *SDS裂解去除脂质分子并破坏细胞膜结构。

      *苯酚氯仿,porém,使其远离沉淀的DNA。

      *纯乙醇提供环境中的H2O分子与DNA塌陷竞争。

      乙醇70%,钠+,因为它允许一价阳离子和盐溶解离开环境。



      • 艾哈迈德 2015年12月12日在下午3:32

        一个添加,
        NaOH的目的,连接DNA的柔性结构。(pH的效果)



  5. 奈斯利亚阿里 2015年10月21日下午6:14

    嗨,尼克,
    我有一个问题??基因组DNA可以用碱性提取法吗?或者这种方法是针对质粒DNA的。

    问候
    纳西尔



    • 戴安娜 2019年7月1日上午2:32

      看看HotShot方法(我们用它来从老鼠尾巴或耳孔进行基因分型)。它是在Jax实验室协议下发布的,非常有名,也可以查看冷泉港。我想第一次出版是在80年代。
      基本上,它在碱性裂解缓冲液(NaOH&EDTA,pH约10)中的加热样品,加热30分钟至2小时,用Tris HCl缓冲液中和(pH约5),然后使用1-2UL进行PCR。



      • 戴安娜 2019年7月1日凌晨2:33

        95C的热量



  6. 理查德杨 2015年7月16日晚上7:51

    我多次使用碱裂解法纯化质粒,取得了良好的效果。我想知道RNA携带在质粒的EtOH沉淀。我一直在四处寻找,并没有发现任何关于这个问题的证据的艰难讨论。我注意到在协议中,Nick建议在加入NaOH/SDS之前加入RNase A。但是,我看不出RNase A在这一步是如何不变性的。我想到,可以加入RNase A + TE缓冲液+溶菌酶+细胞,它们会被RNase A裂解,然后降解RNA。在一个潜伏期后,可以添加氢氧化钠/SDS并继续进行方案。但是,回到RNA的问题。有人知道rna是否随乙醇沉淀物而转移吗?



  7. Agnese Kocere 2015年6月2日晚上11:06

    你好!我对以下情况非常困惑;葡萄糖保持渗透压,因此细胞不会爆裂

    为什么如果你想怀疑他们,为什么试着避免细胞爆裂?

    有人能解释一下吗,也许能更好地解释一下为什么要添加葡萄糖?



    • Shishir Pandey. 2017年2月5日在上午8:11

      添加葡萄糖是因为它作为ph值调节剂。



    • 残酷的 2019年6月30日晚上8点21分

      由于最终目的是破坏细胞,因此没有逻辑使用葡萄糖来维持异常。然而,葡萄糖起着重要作用。添加葡萄糖的目的是将溶液的pH保持在12至12.5之间。葡萄糖具有12.3的pka。在该pH下,基因组DNA Dnatures和质粒DNA保持完整。
      参考。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/?page=2



滚动到顶部
分享Via
复制链接