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作为世界上唯一的光学显微镜、x射线显微镜和电子/离子显微镜的制造商,蔡司为生物医学研究、生命科学和医疗保健领域提供量身定制的3D成像显微镜系统。一个训练有素的销售队伍,一个广泛的支持基础设施和响应服务团队,使客户使用他们的ZEISS显微镜充分发挥他们的潜力。

点传播功能的初学者指南

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点传播功能的初学者指南

假设您具有微小的荧光物体,例如10nm直径的荧光珠粒或甚至单个荧光分子,并且您试图在荧光显微镜下观察其。只要该物体足够亮,即使它远低于显微镜的分辨率限制,您仍然可以看到对象;但它会看起来比它更大。

光线的衍射决定了显微镜的分辨率极限,使任何点状物体模糊到一个叫做点扩散函数(Point Spread Function, PSF)的最小尺寸和形状。因此,PSF是点状物体在显微镜下的三维图像。由于光学显微镜在深度方向上的分辨率比在横向方向上的分辨率差,所以PSF通常比它的宽度高(就像一个橄榄球站在它的尖端)。

那么是什么影响点扩散函数呢?

PSF的变化取决于你所看到的光的波长:较短波长的光(如蓝光,450nm)会导致更小的PSF,而较长的光(如红光,650nm)会导致更大的PSF,因此分辨率更差。此外,你使用的物镜的数值孔径(NA)影响PSF的大小和形状:高NA物镜给你一个漂亮的小PSF,因此更好的分辨率图1(此图表的交互式版本可在蔡司在线教程)。

令人惊讶的是,物镜的放大率不影响PSF -只有NA和波长物质。你可以用珠子来测量显微镜上物镜的PSF,以确定每个透镜的分辨率,并查看每个透镜的状态:受损物镜的PSF通常很大,可能在一个或另一个方向上倾斜。

ZEISS2图1:交互式教程-物镜的分辨能力决定了形成的艾里衍射图案的大小,中心盘的半径由物镜和聚光镜的NAs组合决定。左图像:较小NA产生的图像。右图像:增加NA,提高图像分辨率。您可以访问本教程的交互式版本在Zeiss在线校园。

点扩散函数如何影响我所看到的?

有时,一个真实的标本确实有单点状的荧光物体彼此很好地分开。例如,癌症研究人员在研究DNA修复的复杂过程时,经常照射细胞,观察在双链断裂的点状位点上有哪些蛋白质。这些核焦点是足够小的,当你成像时,你实际上看到的是显微镜下的PSF。然而,在许多情况下,你的标本是一个紧密间隔的荧光团的复杂排列,PSF在你的图像中并不明显。尽管如此,PSF的工作还是很辛苦的,它会模糊你标本中的每一个荧光结构,就像用一支肥厚的画笔描摹出细微的细节一样。

ZEISS1图2:BSC-1非洲绿色猴子肾脏细胞,63x, DAPI染色,Alexa 488(微管蛋白),Alexa 568 (TOMM20)。蔡司Axio成像仪。Z2, Axiocam 506单声道,ApoTome.2。右侧是解卷积图像(ZEN软件)。佛罗里达州立大学迈克尔·w·戴维森提供的样本。

我能做些什么来改善我的形象?

现在,如果我们不嫌麻烦地在显微镜上测量一个特定物镜的PSF,我们能否利用我们已知的PSF的形状和大小来消除它对我们样本的模糊影响?答案是:“是的!”从数学上讲,样品中荧光团的实际排列使PSF模糊的现象称为a卷积用PSF的标本:

标本 ?psf =映像

卷积(?)的符号看起来不是乘法,因为这两个运营商与之相关。我们不知道实际的样本看起来像什么,但我们在显微镜中录制图像,我们也可以录制PSF。一个调用的操作去卷积逆转PSF对标本的影响,就像除法算子反转乘法的效果。实际上,我们永远无法完全了解样本的样子,而是通过使用迭代解卷积算法,我们可以去除一些PSF的模糊的影响,特别是在模糊最差的深度方向上。图2给出了反褶积的结果。

希望这篇文章为您提供了良好的掌握PSF,它如何影响您的图像以及您可以做些什么来最小化这一点。如果您对更深入的更深入,请抬头蔡司在线校园在哪里可以找到一章点扩散函数,它进入了PSF底层数学的细节。

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