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使用油浸入显微镜如何增加分辨率

石油液滴描绘在油浸入显微镜中使用油

使用浸入式显微镜可以帮助您增加光学显微镜的分辨率。反过来,这会导致更好的图像 - 谁不想要更好的显微镜图像?

但是,你知道为什么浸入油和目标用于高功率放大?

你知道吗如何正确使用沉浸式目标?

图像的质量取决于您的数值光圈(NA)和分辨率。NA与显微镜的光学组件的光收集属性有关,而分辨率是您在样品中区分细节的能力。

使用浸入式显微镜可以改善您的分辨率和NA!

现在,让我们看看为什么这样做。

您应该使用油浸入显微镜的原因

折射和折射率的作用

光通过的介质或材料的确切物理特性决定了光的衍射量。这被称为“折射率”,没有单位,而NA也是如此。

有了非剥离(或称为“干燥”)目标,物镜的前镜头和盖玻片的顶部表面之间存在气隙。大多数显微镜载玻片和盖玻片的折射率为1.5,而空气的折射率为1.0。

当光从一个介质到另一种介质(例如从玻璃到空气)传递时,它会“折射”或弯曲和散射。因此,如果您使用干燥的目标,从玻璃盖玻片向空中行驶时,样品中的光线会折射。折射光线通常不会由目标前镜头收集,而是丢失到最终图像中。

现在,如果您使用沉浸式介质更换气隙,则可以纠正此不匹配。大多数商业浸入式油的折射率约为1.51,类似于玻璃。

这就是油浸入显微镜如何改善高功率浸入物镜的分辨率,并通过降低折射来增加NA。

目标的工作距离

当您集中目标并将其移动到幻灯片或盖玻片上时,焦平面会进一步移动到您的样品中。但是,在物镜的鼻子尖端撞到盖玻片之前,您可以走多远是有限制的。比这个距离走得更远,您将不会受欢迎!从冷凝器中清洁玻璃碎片是一项耗时且昂贵的业务。更不用说您可能会损坏客观的前镜头!

当样品处于尖锐的焦点中时,物镜的前镜头和盖玻片表面之间的实际距离(以毫米或微米为单位)称为“工作距离”。通常,放大距离和工作距离之间存在反向关系。具有10倍放大倍率的物镜的工作距离约为4 mm,而100倍油的浸入物镜的工作距离约为130 µm。您可以在目标桶上找到工作距离或刻有“ WD”的目标(只是不要将其与“浸水”混淆)。

天然与合成浸入油

雪松木油

在大规模生产合成替代品之前,雪松木油一直是首选的浸入式油。您今天仍然可以购买雪松木油。但是,这种油可能有很多缺点。

如果使用后未正确清洁,它会穿透并损坏保持目标前镜头的水泥。雪松木油也可以随着年龄的增长而“黄色”,并且倾向于在光谱的紫外线和蓝色范围中吸收光。

合成油

现代合成油旨在随着时间的推移保持颜色稳定,并且相对惰性。尽管这不是避免使用后正确清洁的借口!如果您要进行长期的活细胞成像实验,需要在细胞和舞台周围进行温度控制室,则必须小心选择浸入油。

大多数油设计用于在室温下(即23°C)工作。温度的变化会导致油的折射率变化。实际上,仅1°C的温度差会导致油的折射率变化0.0004。这似乎并不多,但是如果您在许多小时内捕获图像,那么收集的图像和数据中将存在这些微妙的差异。因此,如果您计划使用浸入式显微镜进行这种长期实验,请使用设计用于37°C的商业油。

当心自动荧光

要记住的另一点是一般使用油可以自动燃料。在计划和执行荧光显微镜时,应使用非荧光油。这些油在石油法规或名称之前或之后有字母“ F”。最后,无论您进行什么成像,您都应始终使用显微镜和目标制造商推荐的油。

6个简单的油浸入显微镜的简单步骤

  1. 使用低放大镜找到幻灯片的关注区域。
  2. 将鼻台从低功率移动到40倍物镜,停在每个目标上,以确保您的感兴趣区域仍然处于视眼镜时的视野中心。为了正确设置Koehler照明的显微镜,我们的另一篇文章“如何通过Kohler Inlumination将图像从平庸转变为出版物质量”。
  3. 一旦使显微镜对齐,请小心地将鼻台变成40倍和浸入油的目标之间,但还没有完全使油浸入物镜完全接触。
  4. 将您的注意力从“ Down The Everieces”转移到“显微镜的侧面”。小心地将一滴浸入油直接放在盖玻片上。那是一滴- 您不是在为自行车链上油!
  5. 现在,将鼻齿到鼻台上以充分接合浸入浸入物镜,并将浸入物镜的鼻子与油脂滴接触。一些沉浸式目标具有凹面前镜头。如果您使用其中一种,则还需要在前镜头上添加一滴浸入油,以防止气泡被困在凹凹处中。
  6. 接下来,向下看目镜,并使用只要精细的焦点控制,非常缓慢地使您的样品重新焦点。尽管浸入式鼻锥有浸入式鼻锥,但这并不是邀请聚焦的邀请。快速聚焦在此阶段很容易导致目标破裂盖玻片和滑梯。这是一件昂贵的事故,因此可能导致玻璃(和油)的片段落入替代冷凝器(或倒置显微镜上的目标和鼻孔上),甚至可能损害沉浸式目标的前镜头(最重要的一个)。显微镜的昂贵组成部分。因此,请耐心等待并慢慢集中。

用沉浸物目标完成成像后,清理油。即使您打算在同一会话中再次使用此目标,也可以清理!浸入油可以(并将)穿透显微镜组件并损坏“干”目标,因为浸入油会腐蚀用于将物镜前镜头固定到位的水泥腐蚀。

要清洁浸入物镜,请使用透镜清洁组织仅在一个方向上扫过客观前镜头的表面。继续以相同的方式清洁(使用每次扫描的透镜组织清洁部分),直到在组织上看不到油为止。您还可以使用商业浸入油的液溶液或少量的二甲苯进行最终清洁。与往常一样,请在使用任何解决方案清理目标之前先检查制造商的建议。

希望这有助于您的油浸显微镜,现在您知道为什么以及如何正确使用沉浸式目标。使用浸入式显微镜将有助于提高分辨率,进而导致更好的图像!

要了解更多信息,请查看我们有关NA的其他文章,“”其他数字 - 显微镜中数值光圈的含义”和解决方案,”摩擦显微镜的眼睛:光学分辨率指南”。

有任何有关使用沉浸目标的提示吗?将它们留在下面的评论部分中!

最初于2015年3月31日出版;更新并重新发布了2022年6月

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