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DNA沉淀:乙醇与异丙醇

雨珠的图象在叶子表示DNA沉淀的

作为我们那篇关于DNA和RNA的乙醇沉淀,这篇文章解释了在乙醇和异丙醇中DNA沉淀的区别,帮助你找出哪种方法是你实验的最佳选择。

DNA沉淀要求

首先,让我们回顾我们需要用乙醇沉淀DNA或RNA的组件:

1.盐以中和核酸骨架上的电荷。这使得DNA变得不那么亲水并沉淀出溶液。

2.用冰冷却样品。较低的温度促进了核酸的絮凝,因此它们形成了更大的复合物,在微离心机的离心力下形成颗粒。

3.核酸浓度足够高,以迫使DNA从溶液中(如果浓度不够高,则可以添加载体核酸或糖原以增强恢复)。

4.微量加压散热样品。

异丙醇与乙醇:DNA溶解度

DNA在异丙醇中不易溶解,所以即使在低浓度下也沉淀得更快。然而,缺点是盐也会在异丙醇中沉淀。在乙醇中,DNA需要在更高的浓度下才能絮凝,而盐则易于溶解,即使在更低的温度下也是如此。

DNA在35%异丙醇和0.5米盐中沉淀。使用乙醇,最终浓度需要约75%,盐0.5米。因此,对于典型的沉淀方案,在0.7-1体积的样品中加入异丙醇,并在2-2.5体积的样品中加入乙醇。

选择正确的溶剂:样品体积

如果您促使小体积的DNA,并且可以将所需量的溶剂含量进入样品管中,然后冰冷的乙醇是优选的选择。你可以冷却它(在液氮或在-80℃)以加速沉淀而不会沉淀过量盐的风险。之后,您需要用70%乙醇洗涤颗粒以除去任何存在的盐。

异丙醇对于大型样品体积而有用。使用大量质粒试剂盒后,eluate。因为沉淀需要较少的异丙醇,所以您通常可以将样品和溶剂置于15毫升管中。

然而,因为盐通常不太溶于异丙醇而不是乙醇,它们倾向于与DNA共沉淀。为了使盐沉淀的可能性最小化,在室温下最佳的异丙醇沉淀,培养时间短。

一旦从异丙醇中恢复DNA或RNA颗粒,用冷的70%乙醇洗涤它以除去过量的盐并交换异丙醇的乙醇。它如果你确定样品不含大量的盐,可以将异丙醇沉淀的样品冷却。

因为DNA易溶于异丙醇中,异丙醇允许较大物质和低于乙醇的核酸沉淀,特别是如果您在低温下孵育长时间。

如果你这样做,只要记得在成球后用70%的乙醇清洗几次,以减少你携带的盐的数量。

在短 - 乙醇或异丙醇?

使用乙醇如果:

  1. 你的试管里有足够的空间容纳两体积的乙醇样本。
  2. 样品需长时间保存,并需冷藏。
  3. 你需要沉淀非常小的DNA片段。

如果:

  1. 你的样品体积很大,你只能把1体积的溶剂放进你的试管里。
  2. 你需要大的分子量物种。
  3. 样品中的DNA浓度低。
  4. 你着急,想在室温下加速核酸的沉淀。

方便的技巧

  • DNA乙醇沉淀:
    • 在样品中加入2体积的乙醇,在-20°C下冷冻至少1小时或过夜,以获得最佳结果。
    • 以全速离心20分钟,收集所有材料。
    • 用70%乙醇洗涤,然后离心10-15分钟以沉淀DNA。
    • 记得在削减乙醇时标记颗粒的侧面,颗粒的颗粒是,不要让它从你的视线中放出!
  • DNA的异丙醇沉淀:
    • 避免低温,因为过量的盐沉淀可能会发生。
    • 为了增加沉淀的产率,将样品混合物在室温下温育更长,而不是冷却样品。
    • 当沉淀DNA时,与乙醇颗粒相比,颗粒有时更难以观察。它可以清晰玻璃。再一次,请注意,颗粒应该是颗粒的侧面。在倾析异丙醇和70%乙醇洗涤之前寻找它。
    • 用乙醇洗涤后,颗粒清晰可见,呈白色。在倒出上清液前,确保它不会从管壁上滑落。让管子倒放几分钟,让它风干,或使用离心蒸发器(5分钟足够了),然后在缓冲液中重新悬浮。
  • 最后,对于干燥的DNA颗粒,在50-60°C的缓冲液中加热样品将帮助DNA更快地溶解,但不会DNA损伤。加热也适用于RNA,在水浴中不超过42℃的温度。过度干燥的DNA和RNA将需要更长时间的溶解,因此确保不要蒸发太长。

现在你知道了乙醇和异丙醇沉淀的区别,以及每种方法的使用时间。祝你的DNA沉淀好运!

参考

  1. 绿色MR,Sambrook J.用异丙醇沉淀DNA。冷泉harb protoc。2017(8):PDB.PROT093385。

最初发表于2009年12月10日。2021年8月的更新和重新发布。

雨珠的图象在叶子表示DNA沉淀的

60的评论

  1. 劳拉 2019年12月12日晚上10点13分

    嗨,在我的脚本中,没有提到我们应该使用盐。在不加盐的情况下它还能正常工作吗?还是剧本出了问题?而且我们仍然需要用乙醇清洗颗粒但对我来说,如果我们不加盐,那就没有任何意义。你能帮我一下吗?



  2. 克莱尔 2018年2月2日上午10点57分

    感谢您的清晰解释。它有助于发现美丽的分子生物学世界的学生!bob网站app



  3. 米尔扎 2017年9月20日12:26

    你好,
    谢谢你所有的信息,
    我用Ctab提取DNA,最后用ddh2o稀释,用琼脂糖检测DNA的质量。我在重新包装我的DNA时遇到了一些问题,请告知重新包装我的DNA的协议。

    谢谢来自印尼



  4. yaqub 2017年8月14日上午9点33分

    我想从来自PCR的DNA进行测序,并且我通过琼脂糖凝胶和电洗脱液分离PCR产物,我的目标尺寸为450bp。但我总是在乙醇沉淀步骤中失去我的DNA。I add 3M sodium acetate, glycogen, and 100% ethanol, -20degree 10min, 4degree 15000 centrifuge, I saw my pellet, and wash by 70% ethanol, pellet still there, solubilize it by DW, after a check on the gel couldn’t see any band. which step has a problem?



  5. 马尔基· 2017年6月12日上午6:25

    你好
    我错误地使用50醋酸钠3M为50 ul乙醇沉淀DNA溶液。现在我应该做什么?



    • 阿曼达博士韦尔奇 2017年6月13日下午7:23

      你用过多的醋酸钠吗?如果是这样,那么您可以在其余的降水中按比例增加卷。请记住,您的恢复可能有点较低。



  6. 布鲁斯 2017年6月9日晚上12:53

    谢谢你这个有用的解释。

    如果你能解释一下这个协议是如何工作的,我将非常感激:
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3441248/
    它的作用似乎完全相反:它稀释了使dna从溶液中脱落的盐,它不使用乙醇或异丙醇,它在60度下孵化,而不是在沉淀过程中冷却。

    非常感谢



    • 阿曼达博士韦尔奇 2017年6月13日晚上7:37

      撇去这一点,看起来他们的作者使用磁珠进行降水 - 所以这就是为什么没有酗酒。加热看起来使蛋白质(填充与蛋白酶K相同的角色在DNA提取过程中)。



  7. 戴夫 2017年6月3日凌晨2:56

    在那里,我从组织​​中提取并使用异丙醇,但在加入99%的ISP之后通常的大白蓬松DNA股线不再有,需要高速离心,以获得DNA颗粒,在规格变为200ug之后,这是很多的,我的问题是为什么我不再看到DNA的股线不再脱离解决方案?!这是一批六个,没有人用股线,刚刚变成多云,需要离心......我的解决方案关闭了吗?使用Qiagen Puregene套件,基本上,有裂解缓冲液,蛋白质PPY SOLN和ISP ...... .thats。



  8. 萨拉W. 2017年5月30日晚上10:52

    我正在考虑用乙醇沉淀来净化我的DNA样本希望能提高260/230的比率,这个比率很低。我确实对加入乙醇后将样本冷冻一夜有疑问。我在取样后冷冻了我的组织,我担心乙醇沉淀的另一个冷冻/解冻循环会损害DNA的完整性。对此有什么想法吗?谢谢!



    • 戴夫 2017年6月3日在上午2:58

      只需使用Zymo套件将DNA浓缩并在大约15分钟内清洁DNA,我们使用它来清洁基因组DNA样本,自然污染物在其中含有许多污染物......福尔马林固定,羊水等......



    • Phuong Nguyen. 2017年6月23日下午1:44

      在我的经验中,将DNA保存为乙醇下的颗粒很好,如果不是储存DNA的最佳方法很长一段时间。
      I always having problem with RE digestion of plasmid DNA that are more than 1 week old, longer storage may lead to DNA damage as I see an additional band of nick DNA on agarose gel (no, we didn’t have the nick band earlier because we prep plasmid to obtain supercoiled DNA only).
      最近,我发现,我可以制作大量的质粒DNA,纯化它,用酒精和选择的盐沉淀物,进入10-20 epi,然后将它们置于-80 * c中。我们只需要将等分试样离心并像往常一样用70%的酒精洗涤,DNA始终是最佳的,超级硅化的,消化产品如商业DNA梯子。
      如果你做大量的克隆,它可能会派上用场,不需要每周准备DNA。



  9. 罗姆里奥 2017年5月18日在上午12:39

    你好,第一次提取DNA
    你是用百分之百的乙醇还是百分之七十的乙酸钠盐?然后用70%乙醇洗涤



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