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色谱如何工作:分离科学用5个简单示例解释

在国际象棋游戏中代表色谱如何工作的黑色典当面前的金色典当

样品纯度。我们都需要它。我们都在寻找它。

在生物科学中,大量时间用于净化样品。纯DNA用于转化和转染。纯RNA用于测序。用于测定和结构研究的纯蛋白质。

使用色谱法实现样品纯度 - 分离混合物的成分的过程。

那么,您花了多长时间进行色谱?您使用哪些方法?它多久一次失败和需要优化?

所有这些问题的答案都是“很多”。

让我们快速了解色谱的工作原理。然后,您可以运用对其发展的理解来节省时间,提高样本纯度并实现更成功的实验。

定义的基本色谱术语

就像船上的饼干一样干燥,但是要了解色谱法的工作原理,我们需要定义一些关键术语。这些对于所有色谱方法都是常见的,将帮助您传达实验和目标。

固定阶段

固定相是一种固定的物种,与您希望分离的分子进行化学或物理相互作用。通常,固定相由与聚合物共价关联的化学官能团组成。该聚合物反过来又与色谱柱相关。

移动阶段

流动相是一个溶剂或缓冲系统,它承载您希望通过柱分离的分子以允许分子遇到固定相的方式进行分离。

在成功的色谱实验中,靶分子和杂质在固定阶段具有不同的亲和力。因此,一个人在列上花费的时间比另一个持续时间更长,从而使分离发生。

洗手

洗脱液是流动相的特定化学成分,它导致目标分子从色谱柱中洗脱。请不要将其与手机阶段本身混淆。

例如,在镍亲和力色谱,咪唑是洗脱花。咪唑溶解的缓冲系统是流动阶段。

分析物

分析物是您希望与杂质分开的目标分子。

矩阵

矩阵也称为样品矩阵,是您经过色谱柱的分析物和杂质的组合混合物。

保留时间和音量

保留时间和体积是指分析物在色谱列上花费的持续时间。

相对于分析物注入到色谱柱的时间,保留时间通常是测量的。

相对于分析物注入和分析物检测之间泵送到色谱柱的流动相的量,通常测量保留量。

色谱如何工作:基本原理

柱色谱中的分离取决于差异。

具体而言,分子的化学和物理性质差异。

分子的大小,电荷,极性和溶解度各不相同。在色谱法中,这些差异被利用为在固定相和流动相之间分布分子。

但是,某些分子彼此之间仅略有不同。同样,您希望从中分离目标分子的基质可能包含数千种不同的化学物质。

因此,不可能使用一种适用于每个目标分子的单个分离方法。

这意味着色谱有多种类型。我们将在本文中讨论的五个是:

  1. 疏水相互作用色谱;
  2. 正常/反相色谱;
  3. 离子交换色谱;
  4. 亲和色谱;
  5. 尺寸排斥色谱。

这些方法每种方法都将不同的分子特性与粗样品基质分开。返回这些方法的图形表示(图1),以进行参考,因为我们在本文中移动。


色谱如何用于五种常见色谱方法的图形说明。
图1。五种常见色谱技术的图形表示。

1.疏水相互作用色谱如何起作用

疏水相互作用色谱法根据其疏水性分离分子。

固定相具有与分析物分子的疏水区相互作用的疏水基团。但是他们必须首先相遇。

还记得石油和水不混合吗?那是因为油是疏水性的 - 它没有被水吸引,因为油中没有极性区域可以与极地水分子结合。

相同的原理适用于疏水固定相和水。它们之间没有相互作用。

取而代之的是,在流动相中形成了极性氢键网络。该网络围绕着柱状固定相的疏水组围绕并屏蔽了通过它的分析物。

这样可以防止它们结合到固定阶段。

为了使疏水固定相和分析物之间的结合,必须通过引入混合盐来打破极性氢键的屏蔽。

引入流动相的离子与水相互作用,破坏极性氢键网络,并将疏水基团暴露于固定相。

这允许在固定阶段和分析物之间进行绑定。可以定制流动相和固定相的精确组成,以实现单独的目标分析物。

总之:

  • 分析物在高盐浓度流动相中与色谱柱结合。
  • 使用低盐浓度/交际流动相洗脱分析物。

2.正常/反相色谱如何起作用

还记得喜欢吸引吗?

正常/反相色谱法通过其极性分离分子。

固定相包含高度极性(正常相)或高度非极(反相)函数基团,与分析物相互作用与其极性相互作用。

如果我们回到石油和水的概念而不是混合的概念,我们也可以说,因为水是高极性的,而油是高度非极性的,所以它们不会彼此吸引。取而代之的是,油分子被其他油分子吸引,并且水分子被其他水分子吸引。

换句话说,极性吸引极性,而非极性吸引了非极性。

在正常相相色谱中,固定相比流动相更具极性。由于极性分子保留在色谱柱中,因此非极性分子在极性分子之前洗脱。

对于反相色谱,事物是相反的。您使用一个非极性固定相,该相位保留非极性化合物,使极性分子首先洗脱。

3.离子 - 交换色谱如何起作用

对立也可以吸引。

离子交换色谱根据它们的离子相互作用相互之间的相互作用,分离分子。固定相是一个包含与相反电荷分析物结合的离子官能团的树脂。

因此,如果您想净化带负电的分析物,则将其通过带正电的树脂。不结合(带正电的)或弱结合(稍微负电荷)的分子首先洗脱,而分析物保持与色谱柱的结合。

由于分析物是负电源的,因此该过程称为阴离子交换色谱法。

如果您想净化带正电荷的分析物,则将其通过带负电的树脂。不结合(带负电荷)或弱结合(稍微带正电荷)的分子首先洗脱,而分析物保持与色谱柱的结合。

此过程称为阳离子交换色谱法。

固定阶段的常见类型是:

  • 第四纪酰胺用于阴离子交换。
  • 用于阳离子交换的辛酸。

离子交换色谱中的洗脱分析物

您如何在离子交换色谱中洗脱分析物?

洗脱分析物的一种方法是增加流动相的盐浓度。这些离子与分析物竞争固定相的结合空间,该阶段具有有限的能力。

最终,在足够高的盐浓度下,分析物被移位和洗脱。

另一种方法是改变流动相的pH值,以更改分析物的净电荷,直到它们不再与固定相结合为止。

4.亲和力色谱如何起作用

亲和力色谱法根据其结合的能力分离分子具体的与惰性聚合物共价关联的小分子或生物分子。这些共同包含固定阶段

将亲和力色谱视为一种锁定机制。

固定相的小分子或生物分子是锁,您的分析物是关键。粗样品矩阵本质上是一组键。但是您的分析物是唯一具有互补形状(相互作用)的键,以适合锁亲和力培养基

将分子与固定相结合,使您可以冲洗出不需要的物种。当您准备就绪时,打破互动以收集分析物。

要应用此方法,您必须使用具有定义明确的锁定结合属性的分子。特定结合的示例是在酶和底物,抗原和抗体以及受体和配体之间发现的。

亲和色谱的具体示例包括:

  • 多组氨酸与镍离子结合;
  • 麦芽糖结合蛋白与葡萄蛋白结合;
  • 谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽结合;
  • DNA与肝素结合;
  • 生物素与抗生物素结合。

5.尺寸排斥色谱如何起作用

尺寸排斥色谱法将分子的尺寸分开。简单的。

这种方法,也称为凝胶渗透色谱法或凝胶过滤,与上述不同,因为它利用了分析物分子的物理而非化学的特征。

固定相是多孔珠的树脂,它会捕获小分子而不是大分子。因此,排除具有高分子量和大直径的化合物,因为它们太大而无法适合珠子的毛孔。

至关重要的是,珠子中的孔的大小不是一个值。这是两个限制之间的分布。

这种分布是允许分离的原因,因为如果珠子中的所有孔都是一个大小,则分析物分离将是二进制的。(是的,它确实是分开的,或者没有。不介于两者之间。)

难以使您的头环绕吗?

考虑大小排除色谱法的另一种方法是这样。假设您将大型聚合物样品加载到色谱柱上。在色谱柱上的时间里,聚合物无需进入珠孔即可自由移动,因为它太大了。

同时,小杂质不断进入并退出珠毛孔。

因此,小型杂质保留在柱上的时间长于首先洗脱的聚合物分析物。

这就像将在往后道路上开车的人与乘坐高速公路的人进行比较。

对于较小的分析物,穿过色谱柱的持续时间更长。

摘要色谱法

这就是色谱的工作方式。这就是利用分子特性来迫使分析物将其时间分配在固定相和移动相之间。

如果您可以让分析物在移动或静止阶段花费或多或少的时间,则可以将其与杂质分开。

这篇文章是否为您清除了任何东西?你有其他吗色谱柱色谱法您想让我们知道的方法吗?请通过以下评论添加到列表中!

最初发布于2016年8月。审查并更新了2022年8月。

进一步阅读

  1. Skoog DA,Holler FJ和Crouch S(1997)工具分析原则,第七版。布鲁克斯·科尔:贝尔蒙特
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图片来源:IDS

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