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如何制作自己具有化学能力的细胞

持有DIY的电动工具以描绘DIY化学胜任细胞的人

我曾经经历过无法运行测定的可怕经历,因为我用完了化学转型的库存大肠杆菌((大肠杆菌)。从那天起,我学会了在实验室中制作自己的化学胜任细胞。

我建议每个人都出于三个简单的原因而制作自己的化学胜任细胞。首先,每个分子生物学家都应该学习如何做。其次,它非常简单。第三,它将为您节省金钱并防止紧急情况。

今天,我将告诉您如何制作DIY的化学能力库存大肠杆菌,分子生物学实验室中的主力。bob网站app

您需要的东西

  1. 任何新的过夜文化大肠杆菌在LB肉汤中生长的菌株。
  2. 无菌离心管(即用于Beckman JA-17转子)。猎鹰管也很好。
  3. 用于阅读光密度的光谱仪大肠杆菌
  4. 无菌,冰冷的CACL2在100毫米处。
  5. 无菌,冰冷的CACL2在100毫米处为15%V/V甘油。
  6. 无菌Eppendorf管。

什么是化学胜任的细胞?

化学胜任的细胞基本上是已接受化学物质治疗的细菌,可以使虫子在情况所需时服用质粒DNA(您的实验)。

将质粒进入错误的过程称为转化,化学能力的细胞通过热休克

以及你怎么做大肠杆菌很高兴接受外国质粒吗?您会发现,这些小错误通常不会出于无缘无故地吞噬任何异物(包括质粒)。诀窍是破坏(激活)该细胞膜大肠杆菌因此,质粒将能够在细胞中移动。

能够接受外源DNA的状态称为能力(图1)。

简化的示意图说明了化学胜任的细胞。
图1。简化的示意图,显示了细胞能力。(a)细胞膜完好无损,并且对包括质粒DNA在内的外源性DNA不渗透。细胞是无能的。(b)由于化学处理,细胞膜的完整性受损以产生化学胜任的细胞。(图片来源:托马斯·沃里克

要准备化学胜任的细胞,您需要生长一批大肠杆菌从少量和亚文化中。然后,收集大肠杆菌当它们积极分裂时(在对数增长过程中)。由于人口在对数增长过程中是同步的大肠杆菌最好准备成为转型能力。

因此,在对数期生长过程中收集细胞至关重要。

还,当制作一批化学胜任时大肠杆菌,我们不会在生长培养基中添加任何抗生素。这是因为我们没有放大任何质粒,这是赋予抗生素耐药性的大肠杆菌实验室中的细胞。因此,请注意无菌技术,以免在制备过程中污染细胞。

收集后,用一系列冷的咸缓冲液洗涤小虫子,使膜半渗透到质粒DNA。

将细胞等分,将它们冷冻在-80°C,嘿,普雷斯托!您自己的一批化学胜任细胞。

DIY胜任的单元协议

这是一个简单的逐步协议,可让您在实验室中准备自己具有化学胜任的细胞:[1]

  1. 去准备下面的所有桌子,然后将其全部放在冰箱中。
  2. 与您想要的无纯无菌磅大肠杆菌拉紧。在37°C下过夜,以200 rpm摇动。
  3. 将1 ml的过夜培养物重新注入99毫升无菌lb,并在37°C下以200 rpm摇动,直到600 nm处的光密度(OD)600达到0.3 - 0.5(中对数阶段)。
  4. 在无菌离心管之间平均分配100 mL培养物,并在4°C下以〜7000 rpm的速度离心10分钟来收集细胞。丢弃上清液,并使用P200移液器去除剩下的所有滴剂。
  5. 加入20毫升无菌,冰冷100毫米CaCl2到每个细胞颗粒和轻轻重悬于细胞。让重悬的细胞在冰上冷却约15分钟。
  6. 通过在4°C下以〜7000 rpm的速度离心10分钟,然后丢弃上清液。
  7. 加入5毫升无菌,冰冷100毫米CaCl2为每个细胞颗粒补充15%V/V甘油,并轻轻重悬于他们。
  8. 将重悬的细胞分成无菌的冰质埃彭多夫管中的50 µL等化。
  9. 将化学能力的细胞存储在-80°C下。他们应该保持至少1年的能力。
  10. 通过以已知量(例如1 µL的10 - 50 ng/µl)转换化学胜任细胞的转化效率包含阳性选择标记的质粒并计算转化菌落的数量。
组件 1 M CaCl2 100毫米CaCl2 100毫米CaCl215%V/V甘油
无水CaCl2 11.1 g - -
1 M CaCl2 - 10毫升 12毫升
甘油 - - 18毫升
100毫升 90毫升 90毫升

在开始之前...

我们都知道,清晰的协议并不总是转化为简单的工作流程,并且内幕智慧也很长。这是一些有用的指针:

  • 重要的是轻轻处理细胞因为我们正在削弱细胞膜以使其具有化学能力。这使他们容易受到身体伤害的影响,而死亡错误是无用的错误。
  • 无菌,无菌,无菌。请记住,文化中没有抗生素,因此容易受到污染。检查OD时要特别注意600细胞并将培养物吸入Bunsen燃烧器。
  • 如果您要为整个实验室组构成胜任的单元格,并计划填充(说)整个盒子,然后装满等分试样,那么标记所有管子虽然您的亚文化正在增长。然后将它们放入-80°C的冰箱中以冷却。
  • 另外,抓住一个实验室伙伴和一些液氮在将细胞等分放在存储之前,在宽阔的露珠中。你们中的一个可以将细胞等分为Eppendorf管,另一个可以关闭盖子并将其放入液氮中以冷却。请记住,快速而寒冷。

我真的很喜欢DIY运动准备实验室试剂。诚然,我们很幸运能在这个时代进行科学,因为有很多“套件”可用。但是,学习如何在没有他们的情况下生存总是一件好事。在紧急情况下,这些秘密的“个人股票”可以支付巨大的股息。

另外,在财务紧缩期间,DIY路线始终是预算友好且有用的。那么为什么不尝试制作自己的电动电池也是吗?

您是否找到了准备化学胜任细胞有用的方案?您是否有其他评论或查询要添加?如果是这样,则将它们留在下面的评论部分中。我们已经根据下面的评论进行了审查和更新文章 - 因此您的评论很有用!

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最初发布于2016年8月。审查并更新了2021年11月。

参考

  1. Chang a。(2017)制备钙胜任大肠杆菌和热震转化的制备。JEMI方法1:22–25
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6条评论

  1. 萨马尔 2019年8月21日下午4:17

    我如何确保没有污染
    应该通过培养物进行测试,我的抗生素LB培养基上的组件细胞应该进行测试?



  2. 最小 2019年2月7日上午2:58

    我认为当您存储库存以进行将来的转型实验时,我不需要甘油 - 至少在我上次这样做的时候不需要甘油



  3. 苏珊 2018年11月14日晚上11:36

    什么是丰富的汤?



  4. 托马斯·埃斯帕尔扎(Thomas Esparza) 2018年3月7日晚上7:05

    确切地说,多萝西(Dorothy),我感到惊讶,并希望任何从未做过此协议的人意识到您需要甘油或大多数细胞都会死亡。



  5. 多萝西·恩格尔(Dorothy Engle) 2016年9月8日下午2:32

    冻结步骤没有甘油?



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