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专性QPCR标准曲线

QPCR标准曲线

第一眼,实时PCR看起来像是一种非常简单的技术 - 非常简单。另外,当它优化时,实时PCR会带来有趣的结果。但是,为了获得反映现实的一致和准确的结果,良好的控制对于SYBR QPCR至关重要。这些控件之一是QPCR标准曲线,以检查底漆的效率。

有效的引物对于qPCR很重要

测试底漆在进行任何QPCR实验之前,使用标准曲线是绝对必需的!确保获得的CT值有价值并反映现实很重要。我看到很多学生跳过这一步骤,这是有风险的。收到新底漆后,您通常不耐烦地运行QPCR来获得新的结果。但是,如果首先避免测试底漆,那么您可能会获得错误的结果并损失大量时间。

无论您是使用生物信息学软件设计引物,还是选择一篇很棒的文章中已经发布的序列,这并不意味着您的底漆很好。即使熔体曲线产生了一个漂亮的,干净的单个峰,也不表明寡聚物是可用的。在剂量依赖性的DNA扩增过程中,它们仍然可能不会有效地扩大目标。

因此,您应始终使用QPCR标准曲线测试引物。标准曲线可确保您的底漆有效,精确地检测其目标,这至关重要。

如何执行QPCR标准曲线

要执行QPCR标准曲线,您可以设置QPCR反应以扩增不同量的同一DNA样品。理论上,有效的引物将导致比例剂量反应曲线。

我通常以稀释系数为1:5测试5个浓度。为了获得精确的结果,在每个反应中进行顺序稀释并吸管相同体积的DNA。使用水而不是DNA作为阴性对照,以检测反应中的污染物并区分背景放大。另外,请确保您的DNA样品具有良好的质量(完整的DNA,适当的浓度和良好260/280比率)。

一些QPCR软件具有分析您的标准曲线的应用程序。它生成曲线并计算反应的效率。可接受的范围在90%至110%之间,曲线的斜率约为-3.3,效率为100%。r2曲线应为0.99,以在相关性中提供良好的信心。

如果您对底漆的效率感到满意,但它不是100%,则可以在分析数据时向软件表示,但我从未尝试过。

如果您的底漆不高效怎么办?

出人意料的是,标准曲线会导致不属于的曲线。每个DNA浓度都会产生大致相同的CT值。这意味着引物不能有效地识别目标。

如果这种情况发生在您身上,请首先确保您的DNA样品干净并且不含污染物。如果您的底漆仍然没有有效放大,请设计并订购一对新的底漆。过去,我试图对效率低下的底漆进行故障排除以找到适当的参数(底漆浓度,退火温度等)。我认为,这很少会带来良好的结果。

不良标准曲线可能反映出低DNA表达

标准曲线差可能不会由效率低下的引物引起。如果您的目标在样本中表达不佳,则标准曲线可能不正确。您应该验证该目标是否在您正在学习的单元格类型中表示。如果您的目标表达不佳,请增加用于扩增的DNA的量。

另外,您可以采取预扩增步骤来增加目标的表达,并为其提供商业套件。1您也可以对粗细细胞裂解物进行QPCR,而不是纯化的RNA样品以避免丢失材料。2

标准曲线的另一个优点

除了了解底漆是否有效外,标准曲线还告诉您检测极限。这可以帮助您确定下一个实验中要使用的适当数量的DNA。当您只能使用1 ng时,为什么要使用10 ng的反应?您可以免除珍贵的DNA样品以进行更多QPCR反应。

总而言之,跳过QPCR标准曲线步骤可能很容易。我希望我说服您花时间评估新底漆的效率是多么重要。它可以节省大量时间并带来更好的结果!

参考

  1. Korenkova V等。(2015)在高通量QPCR基因表达实验的背景下进行预扩增BMC mol Biol。16:5。
  2. Van Peer G,Mestdagh P,Vandesompele J.(2012)细胞培养裂解物的准确RT-QPCR基因表达分析Sci代表。2:222。

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6条评论

  1. 统治budodo 2019年10月13日下午2:42

    在我们的实验室中,我们使用Taqman探针运行QPCR。我们使用的PCR套件没有标准样本,因此我们最终仅根据CT值报告PCR结果。我认为通过服用患者样品并将其征服到纳米旋风中以进行浓度估算来制定本地标准样本。这会有所帮助吗?

  2. 自己做 - 生物技术 - 我们是转基因生物 2018年4月10日下午5:07

    […]在校园里有一个Roche,Lightcycler II。这台QPCR机开发了检查为[…]选择的引物的效率所需的标准曲线。

  3. 乔琳 2017年4月12日晚上7:34

    我的标准曲线实验中有CT值,但我不确定如何进行分析并计算效率。我使用的LightCycler属于另一个实验室,他们建议不要在其上使用该软件,因此我想知道我可以使用任何好的,用户友好,免费的软件来进行计算。还是有一种方法可以手动绘制和计算效率,如果我有CT值?
    谢谢,
    乔琳

  4. 塔庞 2016年12月21日上午6:13

    我也这样执行QPCR。
    本文对我的实验非常有帮助。
    谢谢
    此致,
    塔庞

  5. 费利 2016年11月17日下午6:18

    你好,
    感谢您的文章,QPCR确实确实很难开始。在我们的实验室中,我们正在使用Taqman Primers,我想知道这些引物是否还需要标准曲线?
    欢呼,费利

    • Stéphaniebilodeau 2016年11月18日晚上8:51

      嗨,费利,
      感谢您的意见!
      对于Taqman Primers,您可以执行标准曲线,但是对于SYBR Green来说并不必需。该探针使QPCR反应更具体和有效。
      最好的问候,stéphanie

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