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活细胞成像的最佳条件

玫瑰矛:工程人才我

活细胞成像是利用从毫秒到小时的延时成像来研究活细胞的动态生理过程。活细胞成像将多个快照转换成电影,这与固定细胞成像不同,固定细胞成像在一个时间点检查细胞活动。活细胞成像的典型应用是用于研究动力学事件包括酶活性、信号转导、蛋白质运输和膜回收过程。大脑成像显微镜

活细胞成像可以用培养的细胞系(如HEK细胞和HELA细胞)进行,主要细胞培养物如皮肤细胞。您甚至可以使用合适的图像脑切片大脑成像显微镜。生长培养基或基于盐水的培养基配方如DMEM,RPMI和Leibovitz L-15广泛用于活细胞成像实验。制定生长培养基解决方案以支持生长而不影响背景荧光的组分。另一方面,盐水制剂有助于缓冲和光学透明度,但不能用于要求高代谢活动的长期研究。因此,适当的功能细胞对于在显微镜检查期间研究活性生物过程是重要的。但是许多细胞不能使偏差与其最佳生长环境的偏差适应,包括pH,缓冲能力,温度,o2浓度和渗透性。

本文将介绍在活细胞成像实验中如何维护细胞内的原生状态。

pH值

pH值是细胞系有效生长的关键。例如,大多数细胞系在pH值7.2-7.4时繁殖得最好,成纤维细胞在pH值7.7时繁殖得最好,转化细胞系在pH值7时繁殖得最好。为了跟踪细胞生长期间培养基pH值的变化,在某些情况下,酚红被用作pH值的指示物,pH值在pH 7.4时为红色。酚红在酸性溶液中变成橙色(pH 7)和黄色(pH 6.5),在碱性溶液中变成粉红色(pH 7.6)和紫色(pH 7.8)。然而,常用的介质配方在活细胞成像避免苯酚红,因为它的光吸收消光系数高,可能导致背景噪声。

缓冲区

ph缓冲系统通常包含碳酸氢钠和CO的外部供应2。此外,合成生物缓冲液如HEPES可用于短期研究缓冲介质。当细胞外溶液不能被HEPES缓冲时,CO2当与细胞外溶液接触时,送到系统中解离碳酸氢盐。这就是为什么显微镜上的Live-Cell成像通常需要孵育腔室,该腔室专门设计用于调节的大气。一般而言,10-20mm Hepes缓冲液可以在没有CO的情况下控制pH值2有碳酸氢钠的空气为生长提供了最佳条件。

O.2专注

细胞系的O2要求。哺乳动物细胞通常需要氧气进行呼吸在活的有机体内,但仍然可以在成长时替代厌氧糖酵母在体外作为主线或以后的不朽。但严格啊2大多数活细胞成像实验都不需要调节。有趣的是,耗氧常被用作减少与活性氧反应所引起的光损伤的策略。这个策略可能包括O2消耗系统,如氧化酶或抗氧化剂,如维生素C,以限制自由基损害。然而,减少啊2在某些情况下,张力可能导致缺氧应激,这对细胞可能是危险的。

渗透性

大多数细胞系在260和320 mOSM之间的各种渗透值范围内有效地生长。在通过添加HEPES改变宪法时,重要的是监测培养基的渗透性。大多数成像室容纳的小体积介质由于介质温度高而蒸发导致渗透压的变化。在大多数情况下,显微镜有一个co2- 在37时使用哺乳动物细胞的孵育室O.C.低渗介质可以在培养皿中常规取代以补偿蒸发。还可以通过用油或通过控制湿度将介质密封介质或通过控制湿度来最小化蒸发。

哺乳动物细胞实时成像环境控制概述

资料来源:尼康仪器公司[2]

参数 最佳范围
pH值 7.0-7.7.
缓冲 碳酸氢钠或合成生物缓冲液
温度 28-37°C.
渗透性 260 - 320 mosM
大气 空气或5-7%CO2
湿度 97-100%
氧合 变量

尖端

在短期研究中施加大量培养基可能避免渗透和o的偏差2由于蒸发。对于长期研究,可以应用加热装置,加湿孵化室和基于碳酸氢盐的缓冲系统的组合来控制环境参数。

通常应用先进的宽场和共聚焦显微镜技术,以更好地解释活细胞成像实验中的结果。例如,在相比和差异干扰对比(DIC)显微镜下观察细胞生长和显影,但有时优选发育胚胎研究在立体显微镜下观察。另一方面,荧光技术用于标记特定的细胞化合物,其使它们在共聚焦显微镜下更好地观察到。然而,Live Cell成像系统限于某些最佳条件,以确保细胞保持在健康状态。在一起,活细胞成像需要专注于在实验期间功能的细胞和应用特定的实验方法。因此,在这种实验中审查培养基,环境控制,pH和成像技术的应用是重要的,其中最小调整可以改变感兴趣的细胞过程。

参考文献

  1. https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-cience/cell-analysiss/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluoreary/imaging-basics/sample-consirations/Live-Cell-Imaging.html
  2. https://www.microscopyu.com/applications/live-cell-imaging/maintainding-live-cells-on-the-microsoportage.
  3. https://www.leica-microsystems.com/science-lab/live-cell-imaging/
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图片来源:剑桥工程

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