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多重CISRPR基因编辑:它是什么?

内容赞助Sigma-Aldrich®高级基因组学

CRISPR核酸酶的RNA引导性质(例如,CAS9,CPF1)使它们高度适用于多重应用,包括多基因敲除和大规模的基因组修饰。本文 - 多重CRISPR基因编辑的两部分系列的第1部分 - 讨论了这些应用,并概述了多重CRISPR基因编辑实验的实际考虑因素。

新的基因编辑用Crispr?可以找到一般概述这里

为什么多重CISRPR?

有许多CRISPR应用程序从复用中受益,包括多基因敲除,大规模的基因组修饰和Crispr基因组编辑,随着偏移的偏移活动减少。

多基因敲除(KO)

多基因KO是多重CRISPR基因编辑的最明显和概念性的直接应用。只需将多于一种引导RNA(每个指标靶向不同的基因)与CRISPR核酸酶一起提供给细胞。然而,这种过程在实践中并不是如此直截了当,因为双KO的编辑效率将总是低于单个KO。较低的效率意味着您需要筛选更多克隆以获得双重KO的克隆。Triple KOS和更高肯定可以随着CASPR。然而,它们可能需要多轮基因编辑或重大优化来实现。

多基因KO对于靶向冗余基因特别有用,或者用单一基因KO观察到弱表型。[1]

大规模的基因组缺失

CRISPR核酸酶可用于制备大规模的基因组缺失,包括基因切除和染色体缺失。[1]在该规模上编辑需要至少两种侧翼目标基因组区域的DSB。对于此类应用,您可以使用靶向独特的基因组位点的多个GRNA,或靶向靶向基因组区域中重复序列的单个GRNA(即,靶向多个位点的单个GRNA)。前一种方法更适合更精确的缺失,例如外显子或全基因切除。对于染色体级缺失,后一种方法通常提供更好的效率。[2]

使用靶向独特的基因组位点的多个GRNA时,可以通过使用双对GRNA方法来提高编辑效率(即,两对侧翼的靶向基因组区域的GNA)。[3,4]但是,当使用四个以上的GRNA时,您可能会遇到递减返回,因为随着各个GRNA的效率可能会降低,因为您同时增加GRNA的数量。鉴于常用的CRISPREAS(例如,CAS9)的相对较轻的PAM限制,虽然您的里程可能因您使用的核酸酶和目标基因组而变化,但虽然您的里程可能变化,但仍然可以达到多种这样的配对GRNA。

通常,不同GRNA的结合位点之间的距离会影响大规模缺失的基因编辑效率。距离越大,您的效率越低。[1]这可能取决于每个DSB的定时。如果在另一个之前修复了一个DSB,则不会切除中间片段。[5]

减少偏离目标CAS9活动

多路复用也可用于减少单个KO应用中的截止目标效果。通常,这涉及使用CAS9的变型,该类别可以仅在近距离存在时产生DSB。有两个主要工具可用于完成此目的:

  1. Cas9 Nickase [7]:Cas9的工程变体,具有部分烧蚀的核酸酶活性(D10或H840 / N863残基的丙氨酸取代)
  2. DCAS9-FOKI二聚体[8]:CAS9的工程变体,具有完全烧蚀的核酸酶活性,该活性已被融合到限制酶Foki的内切核酸酶。

这两个工具只在配对时工作,并且需要两个唯一的GRNA来启动DSB。单独的Cas9酸酐只会在单链DNA中缺口,并且单独的DCAS9-Foki根本不会出现任何核酸酶活性,部分或不存在。这是因为Foki的核酸酶活性要求它与另一个Foki内切核酸酶结构域形成同型二聚体。要精确的是,配对的DCAS9-Foki酶必须缔结基因组位点不超过15-25个碱基对进行工作[8]。对于Cas9酸碱酶,GRNA结合位点应在理想情况下分开<20bp,但可以在100 bp分开[7]时工作。

这两个工具都大大减少了脱靶效果,因为任何两个偏离目标站点都非常不可能足够接近彼此的接近,以产生偏离目标DSB。但是,有一个权衡,因为这种策略也会产生比正常的Cas9更低的目标效率。

虽然某些应用程序 - 例如多基因KO - 绝对需要多路复用,但其他不再是不总是如此。例如,虽然CAS9 Quidase可以减少偏离目标效果,但这并不总是必要的。毕竟,一些GRNA非常具体!一些应用不一定需要高特异性。但是对于那些做的人 - 例如,治疗应用或产生KO小鼠 - 对于更高的特异性的需求超过了效率较低的成本。

当然,已经提高了一些技术进步,以提高多路复用的优势,同时减轻其缺点。本两部分系列的第2部分讨论了这些进展:CRISPR复用策略:什么是选择?

参考:

  1. B. Minkenberg,M. Wheatley,Y. Yang,支持CASP / CAS9的多重基因组编辑及其应用PROG MOL BIOL晶片SCI149.,111-132(2017)。
  2. F. Adikusuma,N. Williams,F. Grutzner,J. Hughes,P. Thomas,使用CRISPR / CAS9针对整个染色体的删除摩尔蒂25.,1736-1738(2017年)。
  3. y. song等人。,用CRISPR / CAS9系统兔子的高效双SGRNA针对大型基因缺失细胞mol Life Sci73.,2959-2968(2016年)。
  4. J. Han等人,高效通过CRISPR / CAS9缺失大型印迹LNCRNARNA Biol.11.,829-835(2014)。
  5. K.Xie,B. Minkenberg,Y. Yang,通过内源性TRNA处理系统提高CRISPR / CAS9多重编辑能力美国国家科学院的诉讼程序112.,3570-3575(2015)。
  6. F. A. Ran等人,基因组工程使用CRISPR-CAS9系统NAT PROTOC.8.,2281-2308(2013)。
  7. A. E. Trevino,F.张,基因组编辑使用Cas9镍酯方法酶酶546.,161-174(2014)。
  8. J. P. Guilinger,D.B.Thompson,D. R. Liu,催化活性CAS9至Foki核酸酶的融合可提高基因组改性的特异性NAT BIOTECHNOL.32.,577-582(2014)。

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