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T4 DNA连接酶:你需要的唯一连接酶?

DNA连接酶,包括分子生物学动力工具T4 DNA连接酶,是一种酶,通过催化bob网站appDNA链的形成来促进连接DNA链5 ' -PO之间的磷酸二酯键4和3 ' -哦组DNA的主干。在生物体中,DNA连接酶在修复复制和破坏过程中引入的DNA的断裂,从而保证遗传信息的完整性方面发挥着重要作用。

DNA连接酶的发现

考虑到它们在DNA修复和复制中的重要作用,DNA连接酶活性在发现它们之前就被认为存在。两个观察结果促使了对DNA连接酶的研究。

  1. 通过DNA分子的断裂和重新连接而发生的遗传重组。
  2. 噬菌体I的线性DNA在感染后形成封闭的环状结构。

1967年,DNA连接酶被独立地发现盖勒特,雷曼,理查森和赫维茨实验室。自从他们的发现,DNA连接酶已经成为分子生物学的重要工具。bob网站appDNA连接酶用于分子克隆,将DNA片段连接在一起以产生重组DNA,例如将外源DNA片段插入质粒。

大多数连接反应都涉及由限制性消化产生的DNA片段,末端有粘性或钝性。结扎通常作为限制消化后的单独反应进行,尽管一些协议描述a单管PCR克隆方法限制消化和结扎可以同时发生在同一反应中。

T4 DNA连接酶:你需要的唯一连接酶?

T4 DNA连接酶是分子生物学中应用最广泛的连接酶。bob网站app像它的亲戚T3和T7连接酶一样,它以最初发现的噬菌体命名。它是一种依赖于ATP的DNA连接酶,因为它在5 ' -PO的共价连接过程中水解ATP4和3 ' -哦组。

这种多功能连接酶被推荐用于大多数常规分子克隆的应用程序因为它可以连接钝端和内聚端双链DNA片段(通常在质粒载体和插入物之间)以及T/ a克隆。

由于T4 DNA连接酶在连接粘结力和生硬的结束,它已被优化为快速和有效的结扎条件的一系列。T4 DNA连接酶的一些变种已经被设计来承受高盐和高达50摄氏度的高温。这种DNA连接酶在高盐浓度或高温下的连接反应中是有用的。在较高的温度下进行结扎可以缩短孵育时间,增加结扎的特异性。T4 DNA连接酶也被用于快速结扎,该反应在室温下发生5分钟,而不是在16℃过夜,使用特别优化的缓冲区从而提高结扎效率选择快速DNA连接酶,如果你是匆忙!

那么T4 DNA连接酶是唯一需要的连接酶吗?好吧,虽然它在实验室里完成了许多DNA连接酶的标准应用,但它也有一些缺点。

它不是特别耐盐

T4 DNA连接酶的活性开始下降迅速,当盐浓度超过200毫米,所以如果你结扎的条件包括高浓度的盐盐结转时(例如,一个问题从以前的步骤),您可能会遇到问题,最好选择一个替代连接酶。

幸运的是,还有其他选择。T3 DNA连接酶它还可以连接钝端和粘端DNA片段,可以耐受250-300毫米的盐浓度。不过,这并不是你唯一的选择。可以耐受500mm盐浓度的T4连接酶的变体已经被制造出来,例如Salt-T4 DNA连接酶

它连接钝端和粘性端

虽然这一开始可能看起来不像一个问题,但有时当你在一个反应中同时有内聚和钝端DNA时,你只想连接内聚端。在这种情况下,T7 DNA连接酶是你的朋友,因为它不会连接钝的末端。

大肠杆菌DNA连接酶是这种情况下的另一种选择。与T4连接酶相比,该连接酶不连接钝端,对粘性端有较高的亲和力。大肠杆菌DNA连接酶是依赖于NAD+的连接酶,所以你使用的缓冲液和T4连接酶是不同的。

它可以结扎不匹配的尼克斯

T4 DNA连接酶是一种非常活跃的连接酶,一般情况下,DNA连接酶倾向于完全连接Watson-Crick碱基配对的DNA,而T4连接酶可以连接DNA缺口中不匹配的DNA。如果你的目标是高保真的连接刻痕DNA,那么NAD+依赖TaqDNA连接酶是这项工作的工具。

的耐热性的TaqDNA连接酶在较高温度下也具有活性(37-75)oC).在高温下结扎的能力和较高的保真度TaqDNA连接酶减少了重组DNA不匹配的发生率。但请注意,这种酶只能连接刻痕,而不能钝化或粘性末端。

通过选择性结扎刻痕TaqDNA连接酶使它成为完美的解决技术,只有缺口需要结扎和末端结扎需要抑制,如一些DNA组装方法。利用Taq DNA连接酶进行切口高保真连接的应用有很多,包括for单核苷酸多态性的检测和定量。

连接酶的应用概述

虽然T4 DNA连接酶可能是许多分子生物学应用的连接酶的选择,但它并不总是最好的连接酶的工作。bob网站app要快速了解不同连接酶的特性,请参阅下面的快速查找表。

应用程序 T4 T3 T7 大肠杆菌 Taq
粘性末端结扎 ✔✔ ✔✔
仅连接有粘性的末端 ✔✔
平端连接 ✔✔ ✔✔
T /一个克隆 ✔✔
快速结扎 ✔✔*
高温下结扎 ✔* * ✔✔
高盐条件下的结扎 ✔✔* * * ✔✔
切口的高保真结扎 ✔✔
*快速连接酶;**耐高温品种;***耐盐高品种

记住以上几点,应该不难选择一个DNA连接酶为您的下一个结扎应用!你们使用的连接酶不是T4吗?请在下方留言。

进一步的阅读

DNA连接酶,T4在沃辛顿酶手册。沃辛顿生化公司。(2019)。

Shuman, S。DNA连接酶:进展与展望。JBC。284(26); 17365 - 9(2009)。DOI 10.1074 / jbc.R900017200

基于底物的连接酶选择图表。新英格兰生物学实验室。

DNA连接酶选择图。新英格兰生物学实验室。

Lehnman,天然橡胶。DNA连接酶:结构、机制和功能。科学,186(4166);790 - 797(1974)。DOI: 10.1126 / science.186.4166.790

DNA连接酶的底物特异性和错配辨别。新英格兰生物学实验室

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