跳到内容

贤者科学发展为生命科学研究的样品制备技术。我们专注于改善电泳方法和下一代测序工作流程自动化高价值的步骤。

鼠尾草销售皮平™线DNA大小选择仪器,其被广泛地用于DNA,RNA,和芯片起文库构建用于短读测序。我们的系统也可用于制备高分子量DNA为第三代,远程基因组学平台。

我们的产品在我们的总部设在马萨诸塞州贝弗利,美国制造。

如何隔离DNA线粒体:一个充满活力的指南

内容赞助贤者科学

DNA螺旋的手表示隔离

为什么要研究线粒体DNA?

线粒体产生的大多数需要功率细胞过程的多个三磷酸腺苷(ATP)的。这些蜂窝发电厂具有一个16-kb的环状基因组编码的蛋白质的少数,[1]和突变线粒体DNA(mtDNA)与宽范围的疾病,包括听力损失,肌肉障碍,糖尿病,神经退行性疾病相关联,并且癌症。[2,3]

之前,你可以线粒体DNA序列来研究这些和其他疾病,这些突变的效果,你需要首先将其隔离。线粒体DNA的细胞核DNA的不同之处几个基本方面。为了确保分离和测序的mtDNA当你的结果是可靠的,您需要了解并考虑到这些差异。

线粒体DNA的特点

数百个细胞的复制

大多数真核细胞中含有数百个线粒体,数百的mtDNA的拷贝(估计每个细胞线粒体2-10000个拷贝)的。[4]正因为如此,它是常见的单个突变存在于线粒体仅一个子集。因此,不是所有的这些线粒体基因组是细胞或生物体中是相同的。这被称为异质。

高突变率

在大多数生物中,线粒体是母系遗传,并且因为这个单亲遗传重组是有限的。在线粒体基因组变化的其它原因包括缺乏全面DNA修复机制[5]和组蛋白,和高氧化性环境;所有这些都有助于增加突变率。这种异质性可以鉴定疾病相关的基因突变更具挑战性,因为在mtDNA突变往往需要一个阈值水平,观察临床症状之前到达。[6]用于分离的mtDNA需要保留此异质性,并允许进行定量的技术。

Microheteroplasmy

一个生物体的线粒体基因组可容纳数百个独立的突变是在说线粒体基因组的1-2%找到。此microheteroplasmy进一步的mtDNA的分析变得复杂,因为这些突变是不是由标准PCR技术量化。

核线粒体假基因的存在

最后,核线粒体(NUMT)假从线粒体基因的整合引起到核基因组,通常是在非编码区。nuMTs的存在是在线粒体基因变异的鉴定混杂因素。[7]的mtDNA提取方法应有效地去除核DNA,以限制在下游分析nuMTs的干扰。

尽管高拷贝数,线粒体DNA贡献只有0.2%的细胞的总DNA含量。这少数状态,与线粒体DNA的所观察到的异质性沿,需要测序以最大化检测mtDNA突变的能力之前富集线粒体DNA样本。

如何丰富的线粒体DNA

丰富mtDNA的方法有很多,但在选择一种方法之前,你应该考虑以下几点:

  • 您需要为您的下游分析纯度和浓缩程度
  • 您有可用的时间花费在浓缩过程
  • 技能和掌握的水平所需要以执行该方法。

密度梯度离心隔离线粒体DNA

如果你有机会到超速离心机,线粒体DNA富集的金标准是通过密度梯度离心。在此方法中,总DNA加载到氯化铯密度梯度,并在450000×g离心10小时,按大小的DNA分离。此超速离心的结果是DNA的两个不同的频带;较高的核DNA条带和下线粒体DNA带。加入溴化乙锭增强了密度差,从而允许收集,这是通过在适当的位置将针插入所述管和除去线粒体DNA富集较低频带实现在DNA和助剂的更好的可视化。

虽然这是用于分离的mtDNA的有效方法,有几个缺点,包括:

  • 长超速离心步
  • 使用危险和有毒化学品
  • 耐心和灵巧收集线粒体DNA带。

而且,在超速离心步骤和使用皮下注射针的提取从超速离心管中的DNA所产生的力可能会导致DNA剪切。

PCR使用线粒体基因组特异性引

另一个可用以富集的mtDNA低成本方法是利用线粒体DNA特异性引物进行PCR。PCR富集线粒体可以通过使用引物的集合仅使用一个或两个引物组以扩增在线粒体DNA片段或通过远程PCR来实现。[8,9]手册协议已经被优化,结合常规小量制备试剂盒,顺磁性基于珠的纯化和限制PCR扩增富集的mtDNA。该方法具有额外的好处,它不需要任何专门的设备,只有一个PCR机器访问。

虽然PCR扩增确实提供具有成本效益和有效的方式来充实线粒体DNA,从一些限制的方法存在。

  • 使用可能会导致错误,因此很难在线粒体基因组区分真正的突变的聚合酶。
  • 如果你想询问线粒体表观基因组表观遗传标记被丢失或在扩增过程中改变基于PCR的方法也是不合适的。

线粒体分离和富集酶

另一种方法是,以分离和纯化所述的mtDNA之前隔离整个线粒体细胞器。有几种方法可供选择,包括差速离心,它使用多轮离心梯度来分离完整的线粒体的从细胞裂解物。替代地,一些可商购的试剂盒使用的抗体为TOM22,线粒体外膜蛋白易位孔,结合到磁珠以分离线粒体的核心组件。[10]

经由外切核酸酶消化的mtDNA的富集增加这两种方法上述显著的成功。由于线粒体DNA是圆形的,并且核DNA是线性的,即消化线性DNA提供的mtDNA进一步富集核酸外切酶。[11]

虽然结合线粒体分离和核酸外切酶消化,以丰富的线粒体DNA成功的方式,这种方法有以下限制:

  • 这是一个费时,多步法
  • 用途离心多轮这可能损坏mtDNA与导致与核DNA污染(如果通过差速离心分离线粒体)
  • 要求在磁体的形式专门设备来捕获结合至珠粒的线粒体(如果使用磁珠捕获线粒体)。

更简单的方法来富集线粒体DNA

SageHLS™从贤者科学系统提供了线粒体DNA的富集更简单和自动化的方法。在这个系统中,1-1.5百万全细胞被加载到一个专有的琼脂糖凝胶盒一起裂解缓冲液,其通过电泳转移到样品井。一旦细胞裂解发生,细胞内容物通过电泳琼脂糖移动。细胞物质,包括蛋白质,RNA和脂质,通过琼脂糖快速移动。核DNA,这仍然是主要的染色体长度的,被保持在样品孔中,而较小的线粒体DNA迁移到凝胶,从而允许它们的分离。然后电洗脱用于恢复线粒体DNA,其是准备用于下游应用使用诸如在Illumina测序®平台。[12]


线粒体DNA的提取工艺对SageHLS凝胶盒图1的示意性

SageHLS提供线粒体DNA的富集显著的好处。

  • 简单。事先没有细胞的裂解需要。
  • 。从全细胞的样品的mtDNA的富集需要不到3小时。
  • 高效。不需要离心步骤,和核DNA保留在染色体长度,样品中最小化nuMTs。
  • 自动化。细胞被加载到琼脂糖凝胶电泳,提取和大小的选择是全自动的,这意味着你可以离开,专注于其他任务。
  • 有效。得到的纯度水平是可比较的密度梯度离心,和线粒体DNA的20倍富集已经观察到。[12]
  • 温和。DNA不经受长时间或反复离心步骤,这意味着DNA剪切是最小化。
  • 结果。隔离线粒体DNA可直接用于Illumina的平台测序。

SageHLS可从广泛的范围的样品,包括组织和悬浮液的细胞培养物中分离的mtDNA,只要装载到琼脂糖凝胶之前分散样品成单个细胞。

线粒体DNA提取汇总

这是有益的测序,以尽量减少nuMTs它可以分析和您的研究成果产生负面影响的情况下才进行线粒体DNA的富集。这种富集是通过采取的核和线粒体DNA,包括大小,细胞位置之间的差异的优点多种方法实现的,以及它是否是线性或环状的。该方法SageHLS提供纯度和富集可比密度梯度离心的黄金标准以简单,快速和自动的方式,而不需要超速离心。

参考

  1. 安德森S,Bankier AT,巴雷尔BG,序列和结构的人类线粒体基因组性质。(1981年)9(290):457-65。DOI:10.1038 / 290457a0
  2. Ryzhkova AI,Sazonova MA,Sinyov VV,线粒体疾病引起的mtDNA突变:一个迷你审查疗法临床风险MANAG。(2018)14:1933年至1942年。DOI:10.2147 / TCRM.S154863
  3. 泰勒RW和特恩布尔DM。在人类疾病的线粒体DNA突变纳特遗传学牧师。(2005年)6(5):389-402。DOI:10.1038 / nrg1606
  4. 米勒FJ,Rosenfeldt FL,张C,通过基于PCR的检测人的骨骼肌和心肌线粒体DNA拷贝数的精确测定:缺乏与年龄的拷贝数变化核酸研究。(2003年)31(11):E61。DOI:10.1093 / NAR / gng060
  5. Bogenhagen DF。在脊椎动物线粒体DNA修复牛J人类遗传学。1999年64(5):1276至1281年。DOI:10.1086 / 302392
  6. Rossignol的R等福斯坦B;金莎C,线粒体门槛效应。生物化学杂志(2003年)370(3):751-62。DOI:10.1042 / bj20021594
  7. 西蒙娜,D.,卡拉布雷斯,F.M.,郎,M.参考人类线粒体的核序列编制验证,并在UCSC基因组浏览器实现BMC基因组学(2011年)12,517 DOI:10.1186 / 1471-2164-12-517
  8. 拉莫斯A,桑托斯C,Alvarez的L,人类线粒体DNA完全扩增和测序:一个新的有效的引物组线粒体起源共扩增防止核DNA序列电泳。(2009年)三十(9):1587至1593年。DOI:10.1002 / elps.200800601。
  9. 崔H,李锋,陈d,等。整个线粒体基因组的全面下一代序列分析揭示了新的见解线粒体DNA疾病的分子诊断医学遗传学(2013)15,388-94。DOI:10.1038 / gim.2012.144
  10. 弗兰科A,巴里斯OR,Bergschneider E,从小鼠组织和纯线粒体功能的有效分离,使用自动组织破碎和富集抗TOM22磁珠PLOS ONE8(12):e82392。DOI:10.1371 / journal.pone.0082392
  11. 古尔德MP,博斯沃思CM,麦克马洪S,从人血中线粒体DNA的PCR-免费富集和细胞系高品质的新一代DNA测序PLOS ONE(2015)10(10):e0139253。DOI:10.1371 / journal.pone.0139253
  12. 树干C&厚德N.有针对性的线粒体DNA的提取和富集使用SageHLS系统。应用笔记:SageHLS。贤者科技有限公司2019。
DNA螺旋的手表示隔离

3条评论

  1. Dr.ahmed 2020年4月1日下午8时43分

    喜劳拉博士非常感谢

  2. 迈赫迪 2020年4月1日16:42

    嗨亲爱的劳拉。非常感谢

  3. 布拉德Langhorst 2020年4月1日下午4时36分

    基于DNA甲基化的另一种选择:
    https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0076096
    (披露:我曾在此方法)

发表评论

你一定是登录发表评论。

本网站使用的Akismet,以减少垃圾邮件。了解您的意见如何处理数据

滚动到顶部
通过分享
复制链接