跳到内容

CRISPR基因编辑:考虑和开始

内容由Sigma-Aldrich®先进的基因组学

CRISPR-Cas复合物用gRNA靶向DNA图像

CRISPR(聚集,有规律的间隔,短回文重复)-Cas系统在微生物中进化,作为一种防御机制,以防止侵入的噬菌体。今天,它成为生物技术中最令人兴奋和发展最快的一套工具的基础,这些工具使我们有能力编辑任何细胞有机体或组织中的任何基因。CRISPR-Cas有望在从健康和诊断到农业和能源的所有领域实现前所未有的进步。

如果您正在研究如何利用这种技术,本文将帮助您了解入门的基础知识。本文是系列文章中的第一篇,该系列文章旨在帮助您完成您的CRISPR旅程,请在这里查看我们的其他文章

了解CRISPR基因编辑

CRISPR基因编辑过程是由一个由细菌衍生核酸酶(如Cas9)和引导RNA (gRNA)组成的复合物驱动的。gRNA是一种特异性的RNA序列,用于识别和引导Cas核酸酶到目标DNA区域。gRNA由CRISPR RNA (crRNA)和反式激活crRNA (tracrRNA)两部分组成。

  1. crRNA是一个17-20核苷酸序列,与目标DNA互补,因此根据你的目标基因而变化。
  2. tracrRNA是一个不变的序列,作为一个支架将Cas核酸酶连接到rRNA上。

最初的CRISPR编辑系统是由crRNA和tracrRNA两部分gRNA复合物驱动的。最近,单一gRNA (sgRNA)方法,即crRNA和tracrRNA结合成一个RNA分子,由于其使用更加容易和简单而变得流行。CRISPR基因编辑系统的总体示意图如图1所示。

显示不同类型合成gRNA的CRISPR基因编辑系统示意图

图1所示。CRISPR基因编辑系统示意图,显示为CRISPR合成的不同类型gRNA。信贷:SigmaAldrich.com/CRISPR

虽然gRNA可以引导核酸酶靶向,但在靶区下游还必须存在一个由3-8个核苷酸组成的前起子邻近基序(PAM)。对PAM的识别允许核酸酶裂解DNA,产生双链断裂(DSB)。最常用的核酸酶,Cas9来源于酿脓链球菌,识别5 ' - ngg3 '(其中' N '是任何核苷酸)的PAM序列。然而,不同种类的核酸酶对PAM的要求不同,不同种类的核酸酶对PAM的要求也不同。[1]

一旦产生了DSBs,细胞自身的DNA修复机制就会尝试通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复切口。

NHEJ是修复DSB的天然细胞机制。然而,由于NHEJ不使用同源DNA模板将DNA末端连接在一起,因此很容易出错。当这些错误导致核苷酸(indels)的插入或删除时,经常会发生移码突变,导致过早终止密码子的产生和功能缺失(LOF)突变。这种利用NHEJ的方法是CRISPR被用来破坏(敲除)一个基因的主要手段。

相比之下,HDR是利用CRISPR来指导特定基因序列(敲入)的替换和表达的机制。虽然使用相同的基本CRISPR组件,HDR利用DNA供体模板包含新的期望序列两侧的同源区域。当供体模板与CRISPR成分一起被引入时,细胞将使用该模板通过同源重组修复被切断的DNA。结果是新的序列被合并到目标基因中。

开始CRISPR基因编辑

一个典型的CRISPR基因编辑工作流可以分解为以下几个关键步骤:

  1. gRNA设计。
  2. 将编辑复合程序交付到细胞或胚胎。
  3. 细胞的选择
  4. 分析成功编辑的细胞。
CRISPR的设计、交付和分析步骤。

图2。CRISPR工作流的关键步骤。

导RNA (gRNA)设计

gRNA的仔细设计对CRISPR实验的成功至关重要。设计不良的gRNA可能无法产生有效的敲除,或者可能通过结合基因组DNA的其他区域而导致不必要的脱靶效应。这里有一些设计有效gRNA的技巧:

  1. 确保存在一个PAM主题。如前所述,核酸酶需要PAMs来裂解它们的目标DNA。因此,与你的拟核酸酶相关的PAM必须立即出现在你拟gRNA结合位点的下游。
  2. 确保gc含量正确。有报道称gRNA的GC含量会影响gRNA的活性。GC含量过高或过低都会导致裂解效率的降低。[2,3]因此,建议尽可能将gRNAs的GC含量设计为40-60%。[2]
  3. 考虑染色质可访问性。据报道,染色质可达性是sgRNA在体内结合的主要决定因素,成功结合更频繁地发生在DNA的开放染色质区域。[4]
  4. 外显子目标必不可少的。为了产生敲除,重要的是设计gRNA以蛋白质功能必需的外显子为目标,并成功地产生功能缺失突变。
  5. 减少非目标互补。你gRNA序列最好应该是唯一的目标DNA。然而,gRNAs仍可能绑定其他地区,即使互补性不是100%。有各种可用的计算工具,可以帮助您确定您的gRNA有其他潜在的结合位点。

设计你的grna可能看起来很复杂,但是像Sigma-Aldrich这样的在线资源®CRISPR设计工具,使过程简单明了。

将CRISPR导入你的细胞

有多种交付方式CRISPR核酸酶(如Cas9)和gRNAs进入细胞,包括瞬时转染(DNA、RNA或RNP)慢病毒转导, PiggyBac集成,和核糖核蛋白(RNP)转染。区分这些方法的主要特性是它们是短暂地还是稳定地表示CRISPR组件。

瞬态方法最适合个体基因敲除,因为它们与较少的脱靶效应有关,而稳定的gRNA集成对于大规模筛选应用来说是必要的,以便在筛选过程结束时能够恢复和量化。

某些类型的细胞,比如T细胞,很难用质粒载体转染,要么是因为病毒载体引发免疫反应,要么是质粒的传递最终杀死了目标细胞。在这种情况下,核糖核蛋白(RNP系统是常用的。这里的RNP,由纯化物组成Cas9蛋白质与gRNA复合,组装在体外并通过电穿孔或转染直接导入靶细胞。RNP提供更快的基因编辑,因为功能核酸酶可以立即在细胞中获得。RNP复合物被细胞蛋白酶迅速降解,使编辑活性短暂。细胞中可用RNP的时间减少也减少了脱靶效应。总的来说,RNP为实现高水平基因敲除提供了一种有效而直接的方法,效率可达70-80%。[5]

CRISPR选择标记

为了选择那些已经成功转导的细胞,选择标记基因通常被纳入表达CRISPR成分的载体中。

两个最常见的选择标记是:

  1. 通过荧光激活细胞分选(FACS)使被转导细胞富集的荧光蛋白。
  2. 使用适当的抗生素选择被转导细胞的抗生素抗性基因。

选择标记并不局限于媒介介导CRISPR交付方法。荧光团标记的Cas9 RNP配合物,如任务™Cas9-GFP融合蛋白,以及带有荧光标记的gRNAs。如上所述,使用RNP复合物的一个好处是它们可以迅速从细胞中移除。使用标记的RNP复合物可以实时观察转染细胞中核酸酶- grna复合物的清除情况。

在选择选择标记时,一个重要的考虑是你选择的细胞系是否包括任何预先存在的抗生素耐药性或荧光标记,这会干扰选择。

成功基因编辑的测量和分析

了解你将如何衡量你的CRISPR基因编辑实验的成功是至关重要的。有很多选择可以做到这一点,包括桑格测序,错配检测分析,下一代测序(NGS),表型评估,和测量mRNA和蛋白质水平的目标基因。这些方法在灵敏度、可伸缩性、分辨率和成本方面有所不同。[1]

例如,虽然NGS提供极高的灵敏度和分辨率,但它的成本很高,需要大量的技术专长来执行。另一方面,失配检测容易执行,但缺乏Sanger测序和NGS的灵敏度。

确定indel的存在通常被认为是最佳实践。然而,仅仅测量基因组的变化不足以确定它们是否破坏了基因功能,是否产生了导致表型反应的基因敲除。测量蛋白质水平也很重要,最好使用经过验证的抗体。

额外的注意事项

目标细胞倍性和CRISPR编辑

使用CRISPR时,你选择的细胞系的倍性是另一个重要的考虑因素。这是非常重要的信息,因为它决定了获得纯合LOF突变所需的突变数量。许多转化细胞系或癌细胞具有更复杂的基因组构型(例如,三倍体),使它们更难作为完全基因敲除的底物。相反,从单倍体细胞中可以相对容易地获得纯合子突变体。

控制CRISPR基因编辑

为您的基因编辑实验选择正确的控件对于确定结果的有效性和在必要时便于故障排除至关重要。

许多不同类型的控件可以使用CRISPR:

  • 积极的控制:已被证明能够成功靶向你系统中的另一个基因的gRNAs可以用来确认CRISPR在你的设置中正常工作。
  • 消极的控制:非靶向gRNAs,或不以你细胞基因组中的任何基因为靶点的gRNAs,可以用来确认你的LOF表现型不是技术产物。

可以使用其他控件来简化对CRISPR基因编辑实验的解释。例如:

  • 生成多个零突变细胞系使用针对同一基因的不同gRNAs将大大降低你的LOF表型是由脱靶效应引起的几率。
  • 补充方法,如CRISPRaRNAi可用于确认相同的表型。
  • 如果你的细胞允许,考虑执行救援实验在这个过程中,你可以暂时或稳定地将被敲除的基因重新导入细胞系,以确认功能恢复。基因的重新表达可以有效地通过ORF(开放阅读框)过表达确认观察到的表型是基因敲除的结果,而不是由于脱靶效应。

CRISPR基因编辑综述

crispr驱动的基因编辑是当今最强大的工具之一。虽然所需的考虑事项和设计选择的数量可能令人生畏,但您会发现适当的规划将大大提高实验成功的可能性。

本文仅介绍进行CRISPR实验的基本概念和注意事项。我们鼓励您探索下面列出的其他教育资源。

更多的CRISPR资源

  1. 如何验证CRISPR实验(文章)
  2. 如何理解CRISPR格式及其应用(文章)
  3. 利用CRISPR工程Vero细胞系以增加病毒疫苗的产量(研讨会)
  4. 利用合成的sgRNA高效生成基因编辑的小鼠模型和细胞系(研讨会)
  5. CRISPR基因编辑101(电子书)

你也应该考虑一下Sigma-Aldrich®工具:

  1. Sigma-Aldrich®CRISPR
  2. Sigma-Aldrich®先进的基因组学
  3. 高级基因组资源中心
  4. CRISPR必需品
  5. 额外CRISPR在线研讨会

参考文献

  1. Chatterjee, P。高度相似的SpCas9同源物的最小PAM特异性科学的进步, 4,10(2018)。DOI: 10.1126 / sciadv.aau0766
  2. 刘,X。序列特征与CRISPR/Cas9体系的裂解效率相关Sci代表。6: 19675(2016)。DOI: 10.1038 / srep19675
  3. Doench, j·G。et al。高活性sgRNAs对crispr - cas9介导的基因失活的合理设计生物科技Nat》。32(12): 1262 - 7。(2014)。DOI: 10.1038 / nbt.3026
  4. 吴X。哺乳动物细胞中CRISPR内切酶Cas9的全基因组结合生物科技Nat》。32(7): 670 - 676。(2014) DOI: 10.1038 / nbt.2889
  5. Kosicki, M。等一个l不同CRISPR/Cas9投递方法诱导indel剖面的动力学进展Mol Biol Transl Sci152年,49 - 67(2017)。DOI: 10.1016 / bs.pmbts.2017.09.0
CRISPR-Cas复合物用gRNA靶向DNA图像

留下你的评论

你必须登录发表评论。

这个网站使用Akismet来减少垃圾邮件。了解您的意见如何处理数据

滚动到顶部
通过分享
复制链接