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如何理解CRISPR格式及其应用程序

内容赞助Sigma-Aldrich®先进的基因组学

使用工具修改DNA,以表示可用的各种CRISPR工具。

CRISPR基因编辑系统的主要组分是细菌衍生的核酸酶(例如CAS9)和引导RNA(GRNA)。这个相对简单的系统被证明是非常多样的。通过许多修改,研究人员已经开发出来CRISPR格式可用于各种研究,包括基因敲除/敲入,激活,抑制和表观遗传修饰。结果是一个工具箱,使科学家能够在超出系统范围内执行超出基因编辑和调制实验的宽度ZFNS.或Talens。

在这里,我们审查了一般的CRISPR / CAS系统,讨论了两种最重要的替代格式 - 凝血酶和催化死亡核酸酶 - 以及它们在研究中的应用。

CRISPR核酸酶系统

CRISPR系统包括GRNA和CAS核酸酶,其共同形成核糖核蛋白(RNP)复合物(图1)。该RNP靶向并切割特异性DNA序列。RNP的特异性由GRNA提供,由两部分组成:

  1. 含有原间隔子的CRISPR RNA (crRNA);一个17-20核苷酸序列,被设计为与期望的目标DNA互补,并指导RNP-DNA结合的特异性。
  2. 逆激活CRRNA(TRACRRNA),其与CAS核酸酶结合。
CRISPR复合地层的示意图和双链断裂的产生。

图1. CRISPR组分的示意图,展示了RNP的组成以及它如何产生由宿主细胞DNA修复机械修复的双链断裂。信用:sigmaaldrich.com/crispr.

尽管gRNA是将RNP复合物引导到目标DNA的必要条件,但它还不足以成功结合和切割RNP复合物的DNA。在目标序列的下游也需要有一个短序列的DNA,称为原间隔子邻近基序(PAM)。在这种PAM的存在下,RNP复合物结合并通过核酸酶的作用,切割目标DNA,形成双链断裂(DSB)。

各种各样的CRISPR核酸酶每个都识别一个不同的PAM。最常用和最广泛的核酸酶是来自该细菌的“野生型”Cas9链球菌Pyogenes(SPCAS9)。SPCAS9在基因组DNA的非靶标序列中直接识别靶序列下游的5'-NGG-3'的PAM

在所需的目标序列不可用SPCAS9的合适PAM的情况下,可能需要衍生自不同物种的CAS9。几种不同的CAS9版本已与其他细菌种类分离,已发现这些识别不同的PAM。例如,CAS9被隔离链球菌Canis.(SCCAS9)认识到5'-NNG-3'的严格严格的PAM。[1] Cas9孤立Francisella诺维利达FnCas9)像SPCAS9一样,识别为5'-ngg-3'的PAM,但是在'n'位置的偏好方面偏好于a,t或c。与SPCAS9相比,FNCAS9进行的DNA裂解被交错,这导致DBS后的5'突出。

Crispr =

野生型CAS9变体的一个限制是它们具有低严格的DNA互补性,这可能导致偏离目标效果。为了补偿这一点,Cas9凹点已经设计成,产生单链断裂(刻痕,可以由细胞机械修复)而不是双链断裂。例如,研究人员已经介绍了一种D10A点突变,其在SPCAS9中灭活Ruvc核酸酶域,因此工程化酸酐酶只能切割目标链[2]。

因此,为了产生双链断裂(DSB),两种不同但相邻的GRNA与配对旁滴(图2)一起使用。这种方法有效地消除了偏离目标效果的可能性,因为Cas9缩口都必须缩小其目标以产生DSB。

如何配对的乳蛋白酶创造双链断裂的示意图。

图2。如何使用成对的镍酶创建具有内聚末端的双链断线的图示。信用:sigmaaldrich.com/crispr.

此外,当使用两种Cas9镍酶时,产生的不是钝端,而是内聚端,从而对基因的插入和整合提供了更大的控制。这一特性使CRISPR nickases成为在治疗应用中进行基因编辑的理想系统。事实上,nickases已经被用于原代T细胞的基因组编辑以及人类[3]中的病毒DNA(例如乙型肝炎病毒,HBV)的切除。

核酸酶的Cas9

Cas9的核酸酶缺失版本(DCAS9.)已经设计成催化不活性。虽然DCAS9不能切割DNA,但它保持精确靶向DNA的能力,使其能够作为基因组中的特定序列作为货物输送系统。目前用于DCAS9的范围从基因激活和对表观遗传修饰的干扰。在这里,我们探索了其中一些实现

CRISPR激活

CRISPR激活(Crispra)使用改进的CRISPR-DCAS9系统,其包括附着于DCAS9或GRNA的转录激活剂以增加靶基因的表达。大多数CRISPRA系统使用融合到聚合物病毒转移域VP64的DCAS9(图3)。然后通过GRNA将合成转录因子靶向特异性启动子序列。将RNP与额外的共粘膜偶联,例如P65和HSF1,进一步增加了CRISPRA系统的效力[4]。

CRISPRa和CRISPRi的示意图。

图3. CRISPRA和CRISPRI的示意图。信用:sigmaaldrich.com/crispr.

Crispra的一个例子称为CRISPR SAM(协同激活介质)。该平台将VP64-DCAS9与修改指南组合。GRNA含有两个适体,募集额外的共激活剂,P65和HSF1,增强靶基因激活(参见图3)。该SAM已被证明可以增加困难目标的表达,如10月份[5]。

通过富集对表型的不同基因进行富集,还可以作为函数丧失(LOF)遗传筛魂的互补方法[3]。Crispra屏幕显示很少没有偏离目标活动,可用于研究难以使用LOF方法表征的基因,因为它们的高拷贝数。此主题在此处更详细地介绍。

CRISPR干扰

CRISPR干扰(CRISPRi)提供了一种在不改变潜在DNA序列的情况下沉默基因的高效方法。CRISPRi系统基于一个融合到转录抑制因子上的dCas9,例如特征明确的Krüppel相关box (KRAB)结构域(见图3)。KRAB招募蛋白质,导致目标DNA周围的表观遗传抑制(如DNA甲基化)。当定位于基因的启动子时,这种活性会阻止转录机制的招募,有效地沉默基因功能。

Krab-DCAS9 CRISPRI系统已被用于成功沉默非分配神经元的遗传成分,这难以在基因组水平进行编辑[6]。与其他常规使用的基因沉默方法如RNA干扰(RNAi)相比,Crispri表现出更好的靶向特异性[7]。

CRISPR表观遗传改性剂

除了表达调制外,CRISPR-CAS9还可用于制作围绕靶向DNA的表观遗传修饰,允许研究人员直接研究表观蛋白酶。表观遗传效应,例如组蛋白乙酰转移酶,可以靶向感兴趣的基因,以研究这些基因座的表观遗传控制以及以更具原生方式诱导或压制表达。

一个例子是DCAS9-P300 CRISPR基因激活器系统。这使用人P300蛋白的催化组蛋白乙酰转移酶结构域来解开DNA,从而允许基因表达的内源性活化。在实践中,在使用P300-DCAS9激活时,OCT4转录水平已增加至少两倍[8]。

基于CRISPR的表观蛋白组改性也可用于高通量屏幕,以识别和研究特定基因座的功能调节元件[9]。

CRISPR格式摘要

CRISPR基因编辑系统提供了一系列工具,以以几种互补方式研究基因表达。CAS9的工程版本允许有效地减少或消除野生型CAS9的潜在脱靶效果(通过ESPCAS9或CAS9℃),并且具有对基因功能无关调节的特定效用。

此外,dCas9,当与表观遗传修饰,打开了表观基因组直接询问和操纵。

如果您想了解更多有关CRISPR系统的信息,您可以在相关的CRISPR资源中找到其他信息。

更多CrisPr的资源

  1. CRISPR基因编辑:考虑和开始(文章)
  2. 如何验证CRISPR实验(文章)
  3. 使用CRISPR以增加病毒疫苗的工程Vero细胞系(网络研讨会)
  4. 使用合成SGRNA有效地生成基因编辑的小鼠模型和细胞系(网络研讨会)
  5. CRISPR基因编辑101(电子书)

而且你还应该考虑以下西格玛 - aldrich®资源:

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  2. CRISPR慢病毒格式
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  4. CRISPR激活
  5. Cas9蛋白质比较
  6. 西格玛奥尔德里奇®先进的基因组学
  7. 额外的CRISPR网络研讨会

参考文献

  1. Chatterjee,P。极小相似的SPCAS9 Ortholog的PAM特异性SCI ADV.。十月;4(10)(2018)。DOI:10.1126 / sciadv.aau0766
  2. 兰伯蒂,J.使用成对的CRISPR-Cas9 nickase核糖核蛋白对人类细胞进行高效和特异的基因组编辑生物奇(2019) DOI: 10.1101/766493
  3. karimova,m。CRISPR / CAS9乳酸介导的乙型肝炎病毒的破坏开放阅读框架S和X.科学培训5,13734(2015)。DOI:10.1038 / srep13734
  4. 查韦斯,A。Cas9激活剂在多种物种中的比较Nat方法13(7), 563-567(2016)。DOI: 10.1038 / nmeth.3871
  5. Konermann,S。由工程式CRISPR-CAS9复合物的基因组规模转录激活自然517,583-8(2015)。DOI:10.1038 / Nature14136
  6. 郑,Y。基于CRISPR干扰的特定和有效基因灭活大脑Nat Neurosci.21,447-54(2018)。DOI:10.1038 / S41593-018-0077-5
  7. Kampmann,M.哺乳动物细胞中Crispri和Crispra屏幕进行精密生物学和药物bob网站appACS化学杂志13(2),406-416(2018)。DOI:10.1021 / ACSCHEMBIO.7B00657
  8. 吉,问:工程化Zing-Finger转录因子激活Oct4(POU5F1),SOX2,KLF4,C-MYC(MYC)和MIR302 / 367核酸研究42(10), 6158 - 67(2014)。DOI: 10.1093 / nar / gku243
  9. 克兰,T.CRISPR-CAS9表观蛋白酶编辑能够对人类基因组中的功能调节元件进行高通量筛选NAT BIOTECHNOL.35.,561-568(2017年)。DOI:10.1038 / NBT.3853
使用工具修改DNA,以表示可用的各种CRISPR工具。

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