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免疫肿瘤学的CRISPR方法

内容由Sigma-Aldrich®先进的基因组学

T细胞和癌细胞的形象突出了CRISPR可以用于增强T细胞抗癌能力。

T细胞是适应性免疫反应的核心角色,在抵御癌症中起着关键作用。一些癌细胞操纵自身免疫检查点机制来逃避T细胞的检测。程序性死亡-1 (PD-1)检查点受体就是这样一个例子,它通过与配体PD-L1结合而被激活,从而导致T细胞失活。许多癌症通过表达PD-L1配体来应对免疫系统施加的选择压力。

研究人员已开发出治疗性抗体,以靶向并阻断PD-L1与PD-1的结合。阻断PD-1受体可以防止pd - l1介导的T细胞失活。这种失活导致T细胞的抗肿瘤活性增强,从而成为肿瘤学中一个非常重要的临床靶点。虽然使用抗体是一种有效的治疗方法,但也有局限性像CRISPR这样的基因编辑方法有潜力克服这些限制。

T细胞体外编辑作为一种治疗策略

使用治疗性抗体的主要挑战是癌细胞在肿瘤进展期间癌细胞的免疫应答持续失活。这需要通过多轮治疗来持续补充抗体以实现所需的治疗结果。

一种更强大的解决方案是通过直接基因编辑患者的T细胞来破坏PD-1受体。这涉及提取T细胞,敲出PD-1受体,并将修饰的T细胞重新引入血液中(图1)。已经采用了几种基因编辑方法来实现免疫检查点抑制,包括锌手指核酸酶(ZFN),转录激活剂样效应核酸酶(缩略图)和有规则间隔的短回文重复群集(CRISPRS.)。每个系统都具有优缺点。

CRISPR如何用于破坏患者T细胞中的PD-1受体。

图1. CRISPR可用于在重新引入患者之前破坏分离的患者T细胞中的PD-1受体。

基于CRISPR的基因编辑是安全的,具体的,易于使用和高效,使其成为治疗应用的特别有用的方法。研究已经表明该技术的承诺具有Crispr-介导的PD-1中断增强细胞毒性T淋巴细胞和汽车T细胞的抗肿瘤活性。[2,3]

需要注意的是,为了使治疗有效,没有必要分离和编辑患者血液中的每一个细胞。一旦被激活,T细胞就会增殖,产生数以百万计的细胞,然后引发免疫反应。因此,患者的T细胞总数中只有一小部分需要改变。

T细胞基因重编程的挑战

基于CRISPR的基因编辑,同时具有优于用于编辑主要细胞的其他方法,仍存在一些挑战。在这里,我们审查了一些主要障碍,包括递送方法,偏离目标效果和编辑效率。

T细胞中的递送方法

crispr介导的功能基因组学在原代T细胞中的应用很大程度上受到限制,原因是载体传递效率低下,以及传递系统对细胞稳态的不利影响。CRISPR-Cas9机制进入细胞的传统方法是使用病毒载体或基于质粒的传递方法。最近的研究表明,虽然使用这两种方法都可以在T细胞中实现CRISPR基因编辑,但它们的效率低于在永生化细胞中。下面将讨论每种方法的优点和挑战。

Viral-Mediated交付

慢病毒载体永久集成到宿主基因组中,这可能导致宿主细胞中CRISPR-CAS9机械的持续存在的偏离目标效果。其中慢病毒载体整合到宿主基因组中的随机性也可以产生不希望的和不可预测的副作用。

腺病毒(ADV)和腺相关病毒(AAV)载体可以克服随机整合的问题,因为它们没有集成到宿主基因组中。相反,它们存在于宿主细胞内的稳定血肉。但是,这些方法有自己的限制。

小尺寸的advs限制了可以在病毒内包装至约4.5kb的DNA的量。当使用相对较大的核酸酶SPCAS9时,这可能是有问题的。这可以通过使用替代Cas9蛋白,SACA9来克服,SACA9比SPCAS9小约70%。[8]

ad的一个主要缺点是,已知它们可以触发先天性和特异性免疫反应。虽然AAVs不像ad那样触发强大的免疫反应,但AAVs的衣壳可以触发延迟免疫反应,从而导致CD8+ t细胞毒性。[5]

除了上面列出的AAV和ADV的局限性之外,病毒矢量开发昂贵且耗时,使得难以在大规模的治疗环境中实现。

病毒性交付

在淋巴细胞中递送质粒的非病毒技术先前产生了差的结果。然而,将Cas9蛋白作为核糖核蛋白(RNP.)在一些研究中,使用非病毒的方法如电穿孔已证明是成功的[10,11]。在原代细胞中,由于毒性的原因,传递大型转基因一直是一个特别的问题。最近的一项研究克服了这一问题,表明Cas9 RNPs可以用于在原代t细胞基因组的特定位点插入大于1千碱基的转基因,而不会对细胞存活和功能产生有害影响。[12]

通过相关的进展,例如将CRISPRRNA(CRRNA)和转毒CRRNA(TRACRRNA)连接到单一导向RNA(SGRNA)中的相关前进,还提高了初级T细胞的产物也得到了改善,这减少了必须引入的组分数量目标细胞。

与基于dna的方法相比,RNP复合物的递送具有明显的优势,因为它不依赖于细胞表达机制,而且被相对快速地移除,限制了脱靶效应的潜力。如果需要选择标记来分离编辑过的细胞群(例如通过抗生素耐药性或荧光标记),那么使用RNP复合物可能会更加困难。然而,现在可以购买荧光标记的Cas9蛋白。

减少Crispr的偏离目标效果

使用核糖核苷蛋白复合物以最小化脱靶效应

当将细胞重新倾向到患者中时,偏离目标效果的最小化至关重要。使用RNP复合物可以限制这种不需要的效果。与通过慢病毒递送的构建体与集成到基因组,RNP复合物在靶细胞中仅存在瞬时存在。T细胞的快速蛋白质成交量在24小时内降解了这些CAS9 RNP络合物,[10]限制了时间CAS9活跃并减少偏移活动的机会。

用成对的凹口最小化偏离目标效果

另一种限制脱靶效应的方法是成对的使用昵称。在该技术中,使用工程化核酸酶的核酸酶,其可以仅切割一股DNA。对于用该系统发生双链切割,每个酸酶必须与靶向DNA的相同区域的互补导向(GRNA)配对。这使得偏离目标切口的概率如此之低,以至于它们被有效地消除。

交错裂解在最小化偏离目标效果方面的益处

与其他常用的CAS9核酸酶不同,例如孤立的CAS9核酸酶链球菌Pyogenes(SpCas9)和金黄色葡萄球菌(SACAS9),RUVC核酸酶域Francisella诺维利达Cas9(FNCAS9.)以交错的方式切割目标DNA,在5 '端留下4个碱基,具有更高的特异性。然而,FnCas9不编辑人类基因组中的多个靶标,在某些哺乳动物染色质环境中已经进化到失活。近端CRISPR定位方法,又称代理克里克克,[13]利用了FnCas9的这一奇特特性。Proxy-CRISPR以特定靶点的方式恢复FnCas9的核酸酶功能,允许精确编辑,即使是在同一基因组的相同位点之间。FnCas9的使用在本质上比SpCas9更特异,进一步降低了使用CRISPR系统产生脱靶效应的可能性。

提高原代细胞的编辑效率

尽管CRISPR-Cas9系统在永化细胞系中非常有效,但基于crispr的基因组编辑在T细胞中显著降低了效率,即使使用相同的gRNAs。目前的数据表明,效率的降低是由许多因素导致的,包括转染率的差异、启动子相容性、外切酶活性、外源遗传物质引入时干扰素的产生以及人类原代细胞DNA修复的高保真度。为了提高CRISPR系统在原代细胞中的编辑效率,研究人员设计了几种改进方法。

选择GRNA和编辑效率

在两部分合成GRNA系统中,通用TRACRRNA和特定CRRNA仍然分开。当这些组合成SGRNA时,已经显示编辑效率在初级人体细胞增加,包括未激活的T细胞。此外,最近的研究表明,化学改变的SGRNA在初级T细胞,造血干细胞和祖细胞中增加了它们的基因组编辑效果。[14]

研究表明,某些化学修饰增加了RNA的稳定性。[15, 16, 17]基于这些数据,sgrna已被2 ' - o -氨基甲酸酯、2 ' - o -甲基、2 ' - o -甲基3 '硫代或2 ' - o -甲基3?thioPACE在两端的多个核苷酸上。当与Cas9一起引入时(以mRNA或RNP的形式),修饰的sgRNAs在人类细胞系和原代未受刺激T细胞的基因编辑中具有明显的优势。值得注意的是,特定化学修饰的效果取决于序列、细胞类型和交付条件。

RNP和编辑效率

除了改进的交付外,Cas9 RNP复合物在T细胞中表现出较高的编辑效率。用nucleofectin转染这些复合物获得了90%[18]的靶向敲除率,这可以通过电穿孔进一步增强。改良的电穿孔方法在转染前不需要t细胞激活,因此可以用于t细胞分化的研究,同时保持细胞活力。

结合RNP和配对镍酶以提高编辑效率

如上所述,配对乳酸的使用可以减少偏离目标效果。当作为配对尼氨酸的RNP复合物交付时,该方法具有高编辑效率的增加的益处。

与maxcyte合作,我们表明,在外周血单核细胞(PBMC)中,配对尼氨酸系统在5天内导致PD-1蛋白表达的> 80%降低。配对尼斯系统在比单一SPCAS9核酸酶系统更广泛的区域上展开它的诱导,导致更大的表型效果。CD8 + T细胞的其他临床相关靶标,例如CTLA4,TIM-3和TRAC也使用配对尼氨酸的RNP系统以高效率和特异性成功编辑。

结论

T细胞的基因编辑是免疫肿瘤治疗中一种强大的、有效的新工具。与任何新技术一样,在实施该工具时也存在挑战,包括CRISPR机制的交付、脱靶效应的潜力以及编辑效率低。然而,这些问题可以通过谨慎选择CRISPR机制和交付方式来克服。

有关使用配对酸酐rnps进行编辑T细胞的更详细信息,请退房我们的网络研讨会“高效和特异性的基因组编辑与Cas9刻痕核糖核蛋白的原代t细胞“。

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参考文献

  1. Michot赵硕,,与免疫检查点封锁有关的免疫相关不良事件:一个全面的回顾欧j癌症。54:139-148(2016)。DOI:10.1016 / J.EJCA.2015.11.016。
  2. 赵,Z。Crispr淘汰程序的细胞死亡蛋白1增强细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤活性onCotarget.。9(4): 5208 - 5215(2017)。DOI: 10.18632 / oncotarget.23730。
  3. 崔B.D。CRISPR-CAS9破坏PD-1的破坏增强了人胶质母细胞瘤的临床前模型中通用EGFRVIII CAR T细胞的活性J.Immun治疗癌症304(2019)。doi: 10.1186 / s40425 - 019 - 0806 - 7
  4. 李,C.利用腺病毒介导的CRISPR/Cas9编辑CCR5基因抑制HIV-1感染CD4+ t细胞。J Gen Virol.96年,2381 - 93(2015)。DOI: 10.1099 / vir.0.00013
  5. Samulski,RJ。AAV介导的研究和治疗目的的基因治疗性研究为基础1:427-51(2014)。DOI:10.1146 / Annurev-Virology-031413-085355
  6. Mandal, P.K.利用CRISPR / CAS9有效地消融人造血茎和效应细胞中的基因细胞干细胞15(5):643-52(2014)。DOI:10.1016 / J.Stem.2014.10.004。
  7. 吴、Z。基因组大小对AAV矢量包装的影响摩尔蒂18:80-6(2010)。DOI:10.1038 / MT.2009.255
  8. 冉,f.a.,使用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑自然520:186-91(2015)。DOI:10.1038 / Nature14299
  9. Su,S。CRISPR-Cas9介导的高效PD-1破坏来自癌症患者的人原发T细胞Sci代表6,20070年(2016年)。DOI:10.1038 / SREP20070。
  10. 金、S。通过递送纯化的Cas9核糖蛋白,高效的RNA引导基因组在人体细胞中编辑基因组res.24日,1012 - 9(2014)。DOI: 10.1101 / gr.171322.113。
  11. 舒曼,K。使用Cas9核糖核蛋白生成敲入的原发性人T细胞pnas.112(33): 10437 - 42(2015)。DOI: 10.1073 / pnas.1512503112。
  12. 罗斯,t . L。用非病毒基因组靶向重编程人T细胞功能和特异性自然559,405-409,(2018)。DOI:10.1038 / S41586-018-0326-5。
  13. 陈,F。通过近端CRISPR靶向对哺乳动物基因组进行各种CRISPR-CAS系统的有针对性的激活Nat Commun8,14958(2017)。DOI:10.1038 / ncomms14958。
  14. Hendel,A.化学修饰的导向RNA增强人原代细胞中的CRISPR-CAS基因组NAT BIOTECHNOL.33岁,985 - 9(2015)。DOI: 10.1038 / nbt.3290。
  15. Deleavey GF和Damha MJ。设计化学改性寡核苷酸的靶向基因沉默化学。BIOL.19:937-954(2012)。DOI:10.1016 / J.Chembiol.2012.07.011
  16. Eckstein F。硫代磷酸酯,治疗寡核苷酸的必需组分。核酸Ther24:374 - 387(2014)。DOI: 10.1089 / nat.2014.0506
  17. 粗捷,不论是膦酸乙酯和硫代磷酸寡核苷酸的固相化学合成j。化学。Soc。125:940-950(2003)。DOI:10.1021 / JA027983F
  18. 哦,美国。核糖核苷蛋白转染在初级T细胞中的CRISPR / CAS9介导的基因敲除Curr Protoc免疫素124,E69(2019)。DOI:10.1002 / CPIM.69

T细胞和癌细胞的形象突出了CRISPR可以用于增强T细胞抗癌能力。

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