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为什么你应该考虑在你的工具箱中添加CRISPRa和CRISPRi

内容由Sigma-Aldrich®先进的基因组学

DNA转霉病的图像表明CRISPR如何修饰基因表达

CRISPR/Cas9基因编辑已经成为一种越来越流行的解决方案,通过在目标基因组位点产生双链断裂来引入永久性功能丧失(LOF)突变,之后内源性细胞机制修复被剪切的DNA。LOF起源于这个修复过程中移码突变的引入。CRISPR/Cas9系统的适应性扩展了该技术的应用,允许CRISPR介导的基因激活(CRISPRa)和抑制(CRISPRi),而不改变DNA。

CRISPRa和CRISPRi是如何工作的

与常规的CRISPR/Cas9基因编辑相比,CRISPRa和CRISPRi使用Cas9 (dCas9)的催化活性形式。该Cas9变体在两个氨基酸残基D10A和H840A上有点突变,分别使Cas9的RuvC和HNH核酸酶结构域失活。虽然dCas9不能切割DNA,但它仍然被引导RNA (gRNA)精确地招募到目标DNA。合成生物学家利用了dCas9的这一特性,构建了基于dCas9的工具,扩展了CRISPR/Cas9系统的功能。

dCas9可以通过融合或招募适当的转录效应域到非活性的核酸酶上而转化为转录激活物或阻遏物(图1)。常用的转录激活物域包括VP64、NF-?B, eb病毒R反激活因子(Rta)和热休克因子1 (HSF1)激活域。[2]与dCas9结合使用的主要转录抑制因子是来自KOX1的Krüppel associated box (KRAB)域。[3]

图1所示。CRISPRi和CRISPRa利用催化活性Cas9和转录激活因子和阻遏因子来调节基因表达。

在内源环境下,多种转录因子和辅助因子同步作用于刺激基因转录。事实上,CRISPRa工具将多个独特的转录激活子招募到一个启动子中,其表现优于那些具有单个转录激活子结构域或相同效应的冗余副本的工具。[4,5]针对同一启动子上的多个位点也可以增加CRISPRa的基因激活。最有效的CRISPRa效应因子之一是CRISPR协同激活中介(SAM)复合物,它将三个独特的转录激活域招募到目标基因启动子上。在这个系统中,一个转录激活因子VP64 (VP16的多聚形式)直接与dCas9融合。设计成gRNA茎环区域的蛋白结合RNA适配体招募其他两个转录激活域。[5] CRISPRi和CRISPRa复合物只需要与适当设计的gRNA一起表达,即可在哺乳动物细胞中诱导CRISPRi或CRISPRa。

设计CRISPRa或CRISPRi实验的考虑因素

如何设计GRNA

gRNAs的设计不同于CRISPRa或CRISPRi和CRISPR KO,高效的gRNAs以蛋白质编码基因的早期外显子为靶点,阻止可能保留某些功能的截断蛋白的表达。对49个基因的转录起始位点(TSS)周围所有可能的gRNAs进行筛选,可以确定CRISPRi和CRISPRa的最佳靶向窗口。[6]

与它的双重作用机制一致,使用dCas9-KRAB抑制因子的CRISPRi对每个TSS的-50到+300个碱基对(bp)范围内的gRNAs是有效的,表现最好的gRNAs靶向TSS下游的前100个bp。[6]对于CRISPRa,从个体TSS到-400 ~ -50 bp的窗口被确定为最佳靶向区域。[6]该窗口适用于所有CRISPRa效应器,包括SAM系统。[5]

由于CRISPRa或CRISPRi gRNA的有效性受目标基因TSS的接近程度的影响,这意味着对于注释不足的基因组,CRISPRa或CRISPRi的gRNA设计更加复杂。gRNAs对CRISPRa或CRISPRi的效力降低如下:

  • 较长的原间隔子长度(>21 bp)。
  • 在原间隔区存在核苷酸均聚物(如AAAA或GGGG)。

此外,目标基因组区域周围的染色质环境可以限制核酸酶对该位点的访问。[7]

鉴定高活性gRNAs对于构建基因组规模的CRISPRi和CRISPRa文库至关重要。这些文库包括每个基因3-10个gRNA,以确保筛选结果不是由于gRNA的效力不足。[8,9]聚合gRNA筛选为阐明各种因素如何影响gRNA活性提供了一种强大而直接的方法,因为可以用相对较小的努力测试数千种gRNA。[10]

汇集GRNA屏幕还通知GRNA预测算法。观察结果,例如GRNA序列,位置和可访问性的影响,使高活性GRNA的迭代和综合识别能够。[11,12]这导致了高活性和紧凑的(即,每种基因较少的GRNA)GRNA文库,用于CRISPRI和CRISPRA。[9]最终,紧凑型CRISPR库减少了执行基因组尺度屏幕所需的细胞数量。

Sigma-Aldrich®一套功能基因组解决方案包括针对CRISPRi和CRISPRa的优化的全基因组gRNA文库,以及针对单个靶标和大规模文库的定制gRNA设计服务。发现汇总CRISPRa筛查的详细方案

CRISPRa和CRISPRi与竞争技术的比较

CRISPRi和CRISPRa的机制不同于其他基因扰动技术,如RNA干扰(RNAi)和CRISPR KO(图2)。这些差异提供了在选择实施哪种技术时需要考虑的优势和挑战。

图2。与RNAi和CRISPR KO相比,CRISPRa和CRISPRi的作用机制。

CRISPRi与RNAi

CRISPRi的机制不同于其他基因扰动技术,如RNA干扰(RNAi)。RNAi通过利用保守的RNA加工途径降解细胞质中的靶向mrna来抑制基因表达。RNAi所选择的内源性机制的细胞质位置阻止了它有效地靶向核RNA,如ncRNA。[13] RNAi也可以通过取代RISC中的内源性小rna(如microRNAs)来诱导脱靶效应。[14] CRISPRi避免了这些有害的影响,因为所有的组件都来自外部来源。最后,CRISPRi在大规模筛选应用中表现优于RNAi,因为它产生了更稳健的表型,脱靶效应更少。[6]

CRISPRi vs. CRISPR KO

虽然CRISPR基因编辑是产生LOF突变体的一种强有力的方法,但一些缺点使其无法在所有LOF研究中使用。Cas9引起的双链断裂可以诱导细胞毒性和基因组不稳定性,特别是在癌细胞系中。[15,16]此外,大约三分之一的indels不会导致敲除目标基因所需的框移。非编码区域(例如,长非编码rna)很难被Cas9定位,因为它们需要在两个位点进行编辑,才能产生足够大的突变来产生LOF。[17] CRISPR KO也是一种次优的解决方案,用于研究对细胞生存至关重要的基因的影响,而不是在全基因组筛选中进行识别,因为细胞可以耐受这种基因的部分敲除,但不能耐受完全敲除。[10]通过不切割DNA, CRISPRi规避了CRISPR KO的缺点,使其成为扰动非编码基因或要求可逆或可滴定溶液的应用的优越选择。

CRISPRa与ORF过表达

CRISPRa比现有的功能增益(GOF)技术(如开放阅读帧(ORF)过表达)有一些优势。orf的过表达通常利用强大的病毒启动子(例如,CMV)导致生理上的表达水平。由于CRISPRa是针对内源性基因启动子的,所以实现表面转录具有挑战性,这使得CRISPRa更适合于靶向基因的生理或近生理表达的应用。这也意味着CRISPRa更有可能上调目标基因最相关的剪接变体,特别是在它们未知的情况下。最后,基因组规模的ORF库比同等规模的CRISPRa库更难合成。

CRISPRI和CRISPRA通过向复杂的生物过程提供互补的见解,增加了现有的基因组工程技术套件。与Crispr KO不同,它提供二元和永久性结果,Crispra和Crispri可用于可逆滴定滴定的基因表达水平(高达和超过1,000倍)。[2]此外,大规模的LOF和GOF屏幕可以识别唯一,但在功能相关的筛选参数下的唯一且功能相关的位置。SPI1(通过CRISPRA)和GATA1(通过CRISPRI)作为K562人髓性白血病细胞系中细胞生长调节剂的鉴定突出了这种并行使用CRISPRI和CRISPRA的有用性。[6]两种操作都会增加K562细胞中细胞生长,确认SPI1对GATA1活性的已知抑制作用。[19]因此,虽然各个CRISPR屏幕是独立强大的工具,但是当组合使用CRISPRI,CRISPRA和传统的CRISPR KO屏幕时提供强大的验证和加强调查结果,并提供对基因途径的更详细了解。

如何进行CRISPRA或CRISPRI实验

典型的Crispra或Crispri实验涉及三个必要的步骤:

  1. 理想情况下,用适当的CRISPRa或CRISPRi构建稳定的Cas9表达细胞系。
  2. gRNA的交付。
  3. 分析结果。

下面是这些步骤的简要概述;这里有一个更全面的协议

辅助细胞系的生成

所有组分的瞬时转染足以用于有效转染的细胞系(例如,HEK293细胞),而携带型致丧失的转导在各种细胞系中提供更一致和鲁棒的结果。对于大规模的筛选应用,创建稳定的“辅助”细胞系,即在开始时表达DCAS9-Krab或CRISPR SAM复合体允许在筛选过程结束时快速验证。Sigma-Aldrich®.慢病毒载体是否可用于辅助细胞系的生成优化以改善功能性病毒滴度

gRNA交付

GRNA的慢病毒转导,然后进行抗生素选择,确保对小型和大规​​模应用的一致和鲁棒的激活或抑制。慢病毒交付对于汇集CRISPR屏幕至关重要,因为基因组 - 集成的GRNA序列用作后来的碎片折叠的条形码。因此,汇总的CRISPR库应以低(<0.7)多重感染,以确保每个细胞仅接收单个CRISPR副本。[8]

分析

对于小规模应用,分析涉及分别使用定量聚合酶链反应(qPCR)和western blotting测量mRNA和蛋白质水平的变化,以及这些变化的功能后果。汇集CRISPR筛选使用下一代测序分析慢病毒转导的gRNAs在选择过程后的表现变化。

CRISPRa和CRISPRi的应用

CRISPRa和CRISPRi特别适合于基因组和亚基因组规模的筛选应用,包括识别药物靶标[20]和介导耐药性的细胞因子[5],因为gRNA文库可以相对容易地合成、克隆和包装在慢病毒中。CRISPRa和CRISPRi也可以进行阵列筛选[6,5]。两个SigmaAldrich®网络研讨会提供了更多的见解Crispr筛选包括全基因组功能获得筛选的好处CRISPRa、CRISPRi和CRISPR KO筛选的差异

虽然汇总CRISPR筛选比阵列筛选有许多优点,但它通常仅限于研究粗糙表型,如细胞生长和活力。相比之下,几乎任何类型的分析都可以在阵列屏幕上完成,因为CRISPR扰动发生在微效板的单个孔中。然而,单细胞RNA测序的出现提供了一种高含量的转录组分析,可以集成到汇集的CRISPR筛选工作流程中。这是因为每一个CRISPR扰动,包括它的转录组和表型效应,都局限于单个细胞。因此,只要单个细胞可以被分离,CRISPR扰动就可以与转录组读数和表型结果相关联。CRISPR单细胞筛选在Sigma-Aldrich®Portfolio中可以获得与10X基因组学的合作关系。

Crispra可用于研究基因的非编码基因[6]或单个转录物变体,[22]虽然注释的基因组对这些应用至关重要。CRISPRI也能够区分不同的转录变体,与CRISPR KO和RNAi不同,只要映射每个变体的TSS。

概述了CRISPRa和CRISPRi工具

CRISPRa和CRISPRi是一种可逆和可滴定方式调节基因表达的有效工具。这些技术利用dCas9作为合成转录因子,将内源性转录激活因子和抑制因子复合物招募到基因启动子和增强子上,导致基因转录的上调或下调。CRISPRi实现LOF表型,而不受RNAi和CRISPR KO的限制,CRISPRa为大规模过表达筛选提供了可扩展的解决方案。虽然CRISPRa和CRISPRi通常依赖于慢病毒,但这些技术为基因组工程提供了新的可能性。CRISPRi和CRISPRa可以单独用于靶向其他基因扰动技术无法触及的基因组区域(例如,非编码区域),或联合用于揭示离散表型背后的基因调控网络。最后,合并的CRISPRi和CRISPRa筛选可以与单细胞RNA-seq配对,从而实现对CRISPR扰动的高维表征。

更多CrisPr的资源

您还应该考虑以下SigmaAldrich®工具:

参考文献

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