跳到内容

用Crispr升级你的药物筛查

内容赞助Sigma-Aldrich®高级基因组学

微孔板的图像用于表明CRISPR可以扩展到进行药物筛查。

从控制细胞增殖到触发必要的细胞死亡,信号通路对细胞的正常功能至关重要。信号传导的错误在许多疾病中扮演着重要的角色,包括癌症和遗传疾病,并且可以成为有用的药物靶点。然而,这些潜在的药物靶点的识别是具有挑战性的,因为信号通路是复杂的,涉及到大量的蛋白质和分子。

CRISPR筛选

在过去的几年中,CRISPR(聚集的,有规律的间隔的,短回文重复)筛选方法已经成为药物发现工具包的成功补充。[1] CRISPR相关蛋白9(Cas9)是一个成熟的系统,它利用导向rna(gRNAs)以靶向方式操纵单个基因。

通过创建gRNA文库来扩展CRISPR方法,可以在全基因组范围内进行大规模筛选,从而提供特定途径中所有相关基因的概述。[2] CRISPR功能丧失(LOF)和功能获得(GOF)筛选在全基因组水平上都是可能的。[3] 最终,这可以允许对新的药物靶点进行公正的鉴定。[1] LOF屏幕可以通过两种方式实现:

  1. 传统Crispr淘汰(KO),其中直接编辑目标基因以防止功能性基因产物的表达。
  2. 通过防止转录机制表达基因来抑制靶基因的转录,抑制靶基因的干扰(Crispri)。该方法利用催化活性CAS9并且不会发生基因编辑。

Crispr Ko屏幕比RNA干扰(RNAi)屏幕更有效,确保完全基因敲低。此外,CRISPR KO屏幕可能导致比RNAi屏幕更少的偏离目标效果。[4] RNAi对mRNA水平进行基因表达,而CRISPRI和CRISPR激活(克里斯普拉)主要在转录水平上调节基因表达。这使得可以使用CRISPRI和CRISPRA来靶向非编码区域。

CRISPR筛选的一般考虑因素

在规划CRISPR屏幕时,需要考虑五个主要方面,如图1所示。在筛选前考虑这些方面有助于确定最合适的库、格式和总体方法。

图1. CRISPR筛选的一般注意事项

1.试剂和用品

计划CRISPR屏幕时的第一次考虑涉及进行屏幕所需的材料。试剂和蜂窝模型的可用性,成本和可扩展性可能会影响屏幕的设计。例如,如果使用主细胞,则筛选所需的大量细胞可能是不可行的,在这种情况下,可以优选具有高水平增殖的细胞系。考虑到试剂的成本和可用性至关重要,因为这可能会影响屏幕的范围。如果试剂丰富,则全基因组筛网可能是合理的,而如果试剂是限制因子,则较小,更靶向屏幕可能更具成本效益。

2稳定的细胞系生产

许多CRISPR筛选工作流程的第一步涉及表达CAS9核酸酶的细胞的产生和分离。该步骤可以在根据所选择的细胞系上产生的时间和过程中变化,并且是否使用瞬态或稳定转染。Cas9的稳定表达确保核酸酶在筛选中的所有细胞上一致。然而,生成Cas9线比使用瞬态表达式更耗时。对于瞬态和稳定的转染,成功表达CAS9的细胞的分离可以通过抗生素选择或荧光激活的细胞分选(FACS)来进行,这取决于抗生素抗性基因或荧光团是否存在于表达载体中。

三。药物选择

为屏幕选择的药物的作用机制决定了所需的筛选时间以及对筛选的表型决定。如下所述,表型将影响筛选平台的选择。

4富集/表型

应考虑测量的表型,并应根据小规模初步实验的结果来确定对结果的明确期望。汇集屏幕将需要检测允许富集的表型,例如细胞增殖或基于报告的测定的激活。[2]

5. NGS和Deconvolution(用于汇集屏幕)

当规划汇集屏幕时,需要额外的测序和解卷积步骤来识别阳性点击,这需要访问测序设施和生物信息学支持。或者,西格玛奥尔德里奇®反褶积服务是一种从CRISPR筛选中识别关键基因的经济有效的方法。

主要工作流程概述

在分离表达CAS9的细胞后,然后在用感兴趣的化合物刺激之前用GRNA文库转染细胞。屏幕完成后,分析数据,并验证任何潜在的命中。

CRISPR屏幕的具体步骤根据使用池或阵列的库是否有所不同(图2)。

图2.使用CRISPR / CAS9绘制池与阵列方法的常规工作流程。©2015年Agrotis和Ketterer [5],在CC下许可的4.0。MOI,多种感染;SGRNA,单引导RNA。

汇集图书馆屏幕

汇集的库可以在同一管中包含成千上万的GRNA,它们都同时递送至在单个血管中生长的细胞。该步骤需要永久整合(例如,通过慢病毒转导)进入细胞基因组,以确保稍后被扩增的GRNA的持续性以在去卷积期间识别阳性击球。[2]

汇集图书馆如壁虎或Sigma全基因组池为全基因组Crypr屏幕提供成本效益和直接的方法,都是体外体内。然而,随着筛选发生在一个单一的细胞中,将表型与基因改变的链接更复杂。通过基因设定富集收集阳性命中,这限制了评估的表型(例如,增殖或报告基因的表达)。[7,8]在富集之后,需要一种去卷积步骤来识别额外的阳性点击,这使得与阵列的屏幕相比,分析步骤更加复杂。

排列的库屏幕

在阵列库中,细胞生长在多孔板中。通过单个或多个gRNAs的转染,每个孔只有一个基因被靶向。在筛选之后,每个井的表型评估提供了一种简单的方法来识别命中率。[9] 该方法还允许通过高含量成像或细胞表型分析读出多种复杂表型。[5] 然而,阵列方法需要使用能够处理覆盖所有目标所需的大量板材的自动化设备。通过这种方法,筛选时间也直接取决于克隆的数量,使得阵列文库筛选在询问基因子集时比在分析整个基因组时更为可行。

后屏幕考虑

要记住后筛选过程的一些考虑因素不仅包括点击识别的机制,而且包括后续验证步骤。使用池筛时,应使用额外的GRNA对鉴定的靶标进行反射阳性点击,并通过分析蛋白质表达进一步验证并进行详细表征表型。[7]

CRISPR筛选格式

CRISPR筛选可以以各种格式进行,其中许多是可用于缩放用于筛选应用的缩放。常见的CRISPR格式包括CRISPR淘汰(KOS),CRISPR敲击,CRISPR激活(CRISPRA)和CRISPR干扰(CRISPRI)。

CRISPR KO屏幕

在CRISPR-KO筛选中,Cas9在gRNA指定的位置引入双链断裂。当内源性非同源末端连接(NHEJ)DNA修复系统纠正这些断裂时,这通常会导致引入移码突变,从而有效地敲除该基因。[2]

西格玛奥尔德里奇®产品包括慢病毒矢量的CrisprupRul全基因组KO图书馆作为阵列格式,如桑格全基因组文库,[9]或作为汇集的库,如壁虎和西格玛池.

CRISPR敲击屏幕

CRISPR敲入实验涉及将序列插入目标基因,可用于引入单核苷酸多态性、转基因、标签或荧光报告基因。然而,实现CRISPR敲入比KO更具挑战性,因为除了CRISPR机制外,还需要提供供体DNA模板。因此,这种方法目前不容易扩展到单基因靶点之外。

CRISPRa和CRISPRi屏幕

克里普利或CRISPRA都是可扩展的,并通过抑制和转录激活来筛选基因。[10]这些系统使用CAS9的核酸酶缺陷版本(dCas9型),它仍然可以将额外的结构域诱导并募集到GRNA靶位,但不能切割目标DNA。[3,11]在CRISPRI中,DCAS9与转录抑制器(例如Krab)融合,而CRISPRA需要转录活化剂,包括VP64。[11]

最有效的CRISPRa系统使用CRISPR协同激活介质(SAM)复合体.该系统使用DCAS9-VP64复合物,其中两个额外的转录激活活化剂与GRNA一起引入细胞中。[11,12,13]

屏幕的协同使用

利用多种筛选格式提供互补的见解进入相同的途径。[3,10]一个公开的例子显示了一个好处CRISPR在癌症研究中的应用.在该实施例中,使用CrisPRA鉴定K562细胞的肿瘤抑制剂的肿瘤生长筛,而同一系统中的LOF CRIPRI屏幕检测到基本的内政基因。[3]同样,Carrpra在互补毒性筛选时提供有关毒性途径的其他信息。Crispra和Crispri的结合使用鉴定了敏化和敏化K562细胞对蓖麻素治疗的基因。[3]

图书馆选择

为CRISPR药物筛选选择合适的库是一个挑战。西格玛奥尔德里奇®CRISPR产品可以通过提供一系列选择来更轻松地选择合适的库。通过与Sanger Institute,Sigma-Aldrich合作®CRISPR筛查产品包括一个全基因组排列库,用于CRISPR KO以及可以质粒或慢病毒形式传递的阵列库面板。对于集合屏幕,壁虎或Sigma全基因组池,人类激酶池和定制CRISPL面板可用。单细胞分析也是可能的10x基因组学兼容CRISPR池.

Crispr药物筛选总结

CRISPR筛选使用CRISPR-CAS9系统与GRNA文库一次调节许多基因的表达。CRISPR允许LOF(CRISPR KO或CRISPRI)和GOF屏幕(CROFPRA)。CRISPRI和CRISPRA都使用DCAS9与转录压缩机或活化剂融合。

LOF和GOF屏幕的结合使用使得可以识别所研究的途径的压抑和激活组分,从而允许鉴定介导药物或特征耐药于某些药物的下游效果的基因。这种综合协同方法有助于确定进一步调查的潜在新目标。

CRISPR屏幕可以是阵列屏幕或集合屏幕。阵列屏幕,虽然资源密集型的前期,更容易分析和监测复杂的表型。混合筛选更具成本效益,实验更简单,但只能评估一小部分表型,下游数据分析可能会很复杂,因为需要反褶积。

西格玛奥尔德里奇®CRISPR筛选产品包括多种汇集和排列的CRISPR文库,涵盖整个基因组或基因面板,并提供LOF或GOF筛选。附加服务和支持对于您希望了解更多关于哪些筛选工具对其研究需求最有用的研究人员可以使用。

更多CRISPR资源

而且你还应该考虑以下西格玛 - aldrich®资源:

参考

  1. Fellmann,C.,.Crispr-Cas的基石在药物发现和治疗中.NAT Rev Disp Discov。(2017)16,89-100。DOI:10.1038 / nrd.2016.238
  2. DOEAM,J.G。我准备好了Crispr吗?遗传屏幕的用户指南.NAT Rev Gen.(2018)19,67-80。DOI:10.1038 / NRG.2017.97
  3. Gilbert,L. A.,.基因组规模克切普尔介导的基因抑制和活化控制.细胞。(2014)159,647-661。DOI:10.1016 / J.Cell.2014.09.029
  4. 史密斯,我,.通过连接图中大规模基因表达分析评估RNAI和CRISPR技术.Plos Bio。15,E2003213(2017)。DOI:10.1371 / journal.pbio.2003213
  5. Agrotis,A。,.在阵列库筛选中使用CRISPR / CAS9功能基因组学的新时代.前群体。(2015)6。DOI:10.3389 / FGENE.2015.00300
  6. 陈,S。,.基因组 - 宽的肿瘤生长和转移的小鼠模型中的Crispr屏幕.细胞。(2015)160,1246-1260。DOI:10.1016 / J.Cell.2015.02.038
  7. 洛杉矶迈尔斯。,.在体外CRISPR / CAS9屏幕汇集的设计,执行和分析.FEBS J.(2016)283,3170-3180。DOI:10.1111 / FEBS.13770
  8. 杨,J。,.基因组规模Crispra筛网识别细胞重编程的新因素.干细胞报告。(2019)12,757-771。DOI:10.1016 / J.Stemcr.2019.02.010#
  9. Metzakopian,E.,.增强基因组编辑工具箱:基因组宽CRISPR阵列库.SCI REP。(2017)7,1-9。DOI:10.1038 / s41598-017-01766-5
  10. Horlbeck,M. A.,.紧凑且高活跃的下一代文库,用于CRISPR介导的基因抑制和激活.Elife。(2016)5,E19760。DOI:10.7554 / ELIFE.19760
  11. Konermann,S。,.基因工程CRISPR-Cas9复合物的基因组转录激活.自然。(2015)517,583-588。DOI:10.1038 / Nature14136
  12. 查韦斯,A。,.Cas9激活剂在多种物种中的比较.NAT方法。(2016)13,563-567。DOI:10.1038 / nmeth.3871
  13. 特拉甘特五世,等等。基因集浓缩分析:从心力衰竭表型中学到的经验教训.Biodata min。(2017)10:18。DOI:10.1186 / s13040-017-0137-5
微孔板的图像用于表明CRISPR可以扩展到进行药物筛查。
图像信用:Caleb Foster

发表评论

你一定是登录发表评论。

本网站使用AkisMet减少垃圾邮件。了解如何处理评论数据.

滚动到顶部
分享Via
复制链接