跳到内容

贤哲科学为生命科学研究开发了样品预备技术。我们专注于改善和自动化下一个Gen测序工作流程的高价值步骤的电泳方法。

Sage销售PIPPIN™系列DNA尺寸选择仪器,这些仪器广泛用于DNA,RNA和芯片-SEQ图书馆构建,用于短读测序。我们的系统还用于制备用于第3代,远程基因组学平台的高分子量DNA。

我们的产品是在美国马萨诸塞州的贝弗利的总部制造的。

高分子量DNA进行长读测序的尺寸分析

内容赞助贤哲科学

用凝胶电泳的DNA尺寸分析的图像

基因组太大,不能在一件中测序;它们必须首先被切碎成重叠的片段,然后根据其重叠的序列重新组装。测序较少数量的较大片段而不是更大数量的较小碎片使基因组组件更容易且更可靠,因为每件包含更明显的序列。[1]长读数还可以有助于找到大,复杂的遗传变异,并且可以在依赖于微生物DNA指纹的流行病学研究中非常宝贵。

长读DNA测序技术,太平洋生物科学(PACBIO®)和牛津纳米孔技术的两种主要生产商可以常规地产生单分子的长度读数数百千碱基。[1]然而,这些进步在DNA处理和准备中产生了新的挑战。用于长读入测序的高分子重量(HMW)DNA比短读测序中使用的DNA更脆弱需要独特的提取和纯化方法最小化剪切。必须通过评估DNA质量,剪切轮廓和图书馆尺寸来确保起始样品的完整性。这样做的一种方法是通过电泳分析HMW DNA测序文库。本文综述了几种基于电泳的选择,以解决和确定HMW DNA的大小。

在长读DNA测序中质量控制的重要性

短读取测序(75-300bp)中使用的小DNA分子非常稳健,并且可以容易地承受提取程序,珠纯化和剪切方案。通过尺寸分析评估DNA质量通常使用生物分析仪芯片或挂毯(安捷伦)或仅运行MIDI板凝胶来快速而无痛。

相比之下,HMW DNA片段在10 kB的长度超过10kb - 可以在几个图书馆施工步骤中的任何一个中断。建议每次移液步骤(缓慢,带宽孔的提示!)可以将DNA分成可能影响您的测序结果的小片段。在DNA测序期间,文库中的较小分子的存在降低了平均读取长度,消除了长读测序的主要益处:更容易和正确重新组装碎片的能力。[3,4]可以使用Sage Science的Bluepippin高通DNA尺寸选择的方法从文库中除去较短的DNA。然而,这可以根据预选文库的片段尺寸截止和片段大小分布来影响DNA产量。[5]

通过或不尺寸选择,通过评估剪切片段分布和最终图书馆尺寸,评估使用HMW DNA时的起始DNA质量非常重要。以下方法允许您这样做,这样您就可以确保您的长读排序库实际上,从长件DNA开始[5,6]。

基于电泳的分析HMW DNA尺寸的方法

随着任何分子生物学家都可以告诉您,凝胶电泳通过使用电场通过分子筛移动DNA。小分子通过更容易且迅速地穿过筛子,而较大的分子将缠绕并移动更慢。您可以通过将其在凝胶中的位置与已知标准的位置进行比较来确定DNA样品的大小,通常以尺寸梯子的形式。尽管如此,分辨超过孔径的HMW片段是有问题的,因为较大的分子(15-20kb)根本不能通过凝胶。已经开发了几种电泳方法,具体是为了解决这些较大的DNA分子。

脉冲场凝胶电泳

在20世纪80年代初,Shwartz和Cantor [2]的开创性工作表明,使用交替的脉冲电场而不是直流可以将HMW DNA分解为2000 kB。[2]在脉冲场电泳,电压在三个方向上周期性地切换,而不是持续运行。[3] DNA分子通过根据其尺寸通过以不同的速率调整它们的电荷来响应电压变化,较小的碎片更快地调节。随着时间的推移,即使是长DNA股线的推进。

这两个步骤前进,一步回来“方法是分离大块DNA的有效方式。但是,它可能是复杂,耗时的,并且需要专门的设备。字段逆转通常短(毫秒至秒),并且通常逐步调制以达到所需的结果。例如,用户可能在片段大小范围内需要高分离,同时保持在A和另一个片段范围内的高压缩。图1提供了几秒钟的脉冲场模式的示例。

图1.脉冲场反转模式的示例[7]

Femtopulse(脉冲毛细管)

安捷伦的幻影是一种基于毛细管的系统,可以将DNA分解为1300bp至165 kB。这种尺寸范围在PACBIO的单分子测序文库的分布范围内,其通常在15kb和100kb之间。然而,165kb的最大限制可能无法提供更大的碎片分布的精确描绘,例如牛津纳米孔系统。

Fremptopulse是测量图书馆尺寸分布和质量检查启动DNA的好方法(DRADed DNA含有涂抹在50 kB以下的片段)。它在平板凝胶上的主要优势是其用户友好的分析软件,可快速提供准确的尺寸和量化。当样品尺寸有限时,也是优选的。Femtopulese是昂贵的,因此它可能最适合专用的高吞吐量实验室,其成本可以是合理的(例如,使用Pacbio Sequel II或Oxford Nanopore Promethion的实验室)。

厨师映射器(脉冲场凝胶)

Biorad Chef Mapper XA系统基于Schwartz和Cantor的工作,[2],但允许在脉冲场的角度上进行更大的灵活性。它可以将超高分子类别的DNA片段分解,从100bp的长度高达10 mb。非线性开关 - 时间斜坡在运行期间改变开关时间增量,将50到700 kB的单独碎片分开。通过释放在凝胶基质中粘在凝胶基质中的大型DNA分子可以促进较大分子的分离和分辨率。厨师映射器比Femtopulese更实惠,但需要第三方凝胶成像软件。在缺点中,与典型的琼脂糖凝胶设置相比,它是一个大的装置,并且可能需要水再循环。

Pippin脉冲(现场反转凝胶)

贤哲科学Pippin脉冲是一个简单的选择,分数是​​毫微微疏松或厨师映射器的成本。它在典型的Midi-Gel尺寸框中使用具有增强铂电极的典型Midi-Gel尺寸框来承受脉冲方案。Pippin脉冲可以解决高达400 kB的DNA,可以处理PACBIO或牛津工作流程中的大部分琐事,并占用很少的长凳空间。凝胶像任何Midi-Gel一样投射,它使用标准电源。运行凝胶时,简单的软件适用预设或用户定义的脉冲字段或直流协议。与厨师映射器一样,三方成像软件需要大小化和量化。图2示出了Pippin脉冲协议的示例。

图2. Pippin脉冲协议的示例[7]

用于分析HMW DNA尺寸的电泳基方法概述

下表提供了用于分析HMW DNA尺寸的基于不同电泳的方法的概述,基于成本,规模,分辨率以及对第三方软件的任何需求。

方法
(公司)
方法 解析度 成本 尺寸 需要第三方设备/软件?
幻影

(安捷伦)
毛细管电泳 1300 bp到165 kb 最高 51 x 61 x 35cm
厨师映射器

(Biorad)
脉冲场凝胶电泳 高达10 MB midrange. 55.9 x 34.5 x 30厘米 是的
Pippin脉搏

(贤哲科学)
现场反转凝胶电泳 高达400 kB 最低 7 x 20 x 24 cm 是的

如果您从Long DNA的完整片段开始,您只能收获长读序列的好处。这些工具可以帮助确认您的HMW在隔离和净化过程中未剪切,使您可以获得可清洁的读取。

参考

1. Kumar Kr,Cowley MJ,Davis RL。下一代测序和新兴技术Semin Thromb Hemost。2019年;45(7):661-673。DOI:10.1055 / s-0039-1688446

2. Schwartz DC和CAROR CR。脉冲场梯度凝胶电泳的酵母染色体大小分离。细胞。1984; 37,1. DOI:10.1016 / 0092-8674(84)90301-5

3.SMRTBELL™模板准备简介。太平洋生物科学产品文档。

4.拼离™和PROMETHION™的测序库准备。牛津纳米奥波尔产品文件。

5 Schalamun,M.等利用该矿井:如何建立长时间的一个例子?使用来自桉树育植物的挑战性植物组织在实验室中读取测序MOL ECOL Resour.。2019; 19:77-89。DOI:10.1111 / 1755-0998.12938

6.漂流,J.,使用续集系统进行全基因组测序的最佳实践。太平洋生物科学科学海报,2018年。

7。Pippin Pulse用户手册。贤哲科学产品文档。

用凝胶电泳的DNA尺寸分析的图像
图像信用:迈出

发表评论

你一定是登录发表评论。

本网站使用AkisMet减少垃圾邮件。了解如何处理评论数据

滚动到顶部
分享Via
复制链接