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准备中期蔓延:细分细胞上的故障

动画片染色体的图象在简单的背景散开了与一个拷贝染色体的在焦点素的准备的中文地区蔓延

细胞遗传学是遗传学的一个分支,专门研究染色体。基因组中的染色体不稳定性和染色体重排被用来诊断和定义一些遗传疾病,甚至一些癌症。[1, 2]研究人员使用多种技术来识别染色体的结构,包括荧光原位杂交(FISH)、核型分析、流式细胞术和比较基因组杂交(CGH)。BOB棋牌

即使您不是一个细胞遗工,您可能需要评估某种细胞系中的染色体不稳定性,例如,在使用它们的论文项目之前(特别是如果您使用胚胎干细胞)。[3,4]

评估染色体不稳定性或染色体重排的第一步是收获染色体,其本身可以是艺术形式的一点。

准备中期传播的第一步

首先,在你采集细胞之前,你的细胞需要达到80%的融合度(并且是健康的!)。如果你没有足够的细胞,你可能最终没有足够的染色体进行进一步的分析。

阻止细胞周期

下一步是阻止细胞周期。在中期截取细胞周期对研究染色体来说是至关重要的,因为这是染色体最浓缩的时刻,便于观察。一些常见的中期阻滞药包括秋水仙碱、地霉素、长春碱和诺可达唑。(5、6)

Demecolcin或Colcemid是最常见的化合物,用于捕获中期蔓延的细胞周期。[7,8] COLCEMID是秋水仙碱的合成类似物,其剧毒。[9,10]像血晶胺一样的长春碱是在植物中发现的天然化合物,但也已被证明是影响DNA合成,这很可能为什么不用于中期扩散。[11,12]

这些化合物中的所有四种化合物通过稳定的微管搅拌中期的细胞,这防止了主轴组件并激活主轴组件检查点。当与这些化合物中的任何一种一起温育时,细胞将不能进入后源。

收获的时间

一旦你在中期阻止了你的细胞,是时候开始收割了!这几乎与收集细胞颗粒的方法相同,除了你将保留介质与秋cemid,而不是倒出它。将含有秋水仙素的培养基倒进一个锥形管中,然后使细胞胰酶化。一旦细胞分离,用保存下来的秋水仙碱添加培养基稀释胰蛋白酶。离心你的细胞,除去上清,你就会有一个中期阻滞的细胞小球。

这是第一个棘手的部分:使细胞脆弱。对于中期蔓延,我们需要破裂细胞膜以帮助可视化染色体。细胞需要精细使它们在掉在显微镜载玻片上时将突发。

为此,我们需要向细胞添加低声溶液,其相对于细胞内部具有较低浓度的溶质。这导致渗透梯度在外部和细胞内部之间形成形成。因此,添加低级溶液使细胞膨胀,使它们非常脆弱。想想像水气球这样的细胞:你想要他们足够完全,以便他们在击中某些东西时爆裂,但不够完全闯入你的手!

实现这种平衡的最简单方法是一次每次添加低声解决方案,而不是立即添加全部量。这样,您可以缓慢慢慢悬垂您的细胞,从而允许均匀膨胀。你想确保你的管中没有丛生的细胞。轻轻地敲击管应分解任何不需要的细胞团块。用于中期涂抹的最常见的低渗溶液是氯化钾,但有些方案使用柠檬酸钠。[13-15]

有这种想法

一旦细胞被低渗溶液孵育,你就想把它们固定在这种膨胀状态,这样它们就可以储存起来以备将来使用。甲醇和醋酸的结合似乎是最常见的染色体收获固定方法。单独使用甲醇等酒精会导致细胞萎缩。加入与肿胀有关的醋酸,可以使细胞保持不太肿胀的状态。你可以将这些细胞作为颗粒在4°C下储存一年,或者直接进行下一步。[7]

准备幻灯片

将中期染色体扩散到幻灯片上是染色体收集中最困难的部分,关于哪一步对最终扩散影响最大,有很多争论。

一旦您准备好使您的中期蔓延,几次将你的细胞颗粒重悬于新鲜固定剂中。在将它们丢弃到幻灯片之前,这将有助于摆脱任何细胞团块。

诀窍是让重力为你做这件事,但你可能需要花一些时间优化距离。如果幻灯片和移液管之间的距离太大,你的染色体就会分散得太远。当染色体相距太远时,可能很难确定它们是来自一个细胞还是两个细胞。如果你想评估细胞的倍性,这可能是个大问题。[16]

如果你的幻灯片和移液管之间的距离太小,你的染色体就会重叠并被压在一起。当你的染色体重叠时,你将无法区分它们。这将使任何你可能做的染色很难评估。使用一次性移液管将细胞滴到干净的载玻片上,但请记住,移液管的直径也会影响染色体在载玻片上的扩散。

湿度是中期传播过程的关键组成部分,似乎是影响染色体在玻片上传播的最重要因素。这种固定剂从空气中吸取水分,使现在破裂的细胞重新水合。控制好这个补水过程是美中期传播的关键!

保持滑片湿度的两种最常见的方法是:

  • 在将电池滴到它们之前,将滑块与水略微潮湿(通过将载玻片浸入水中或预冻干),然后允许它们在热块上干燥。
  • 使用干幻灯片,滴下细胞,然后立即将载玻片放在覆盖的水浴中的托盘上。

方法的选择取决于个人,但总的信息是保持湿润!

干燥载玻片时,根据方案,温度可从20°C到75℃。[6,7,13,18,19]更高的温度会导致固定剂过快地干燥。太冷的温度可能导致幻灯片上的水分增加,因为冷空气不能像暖空气那样占用水。这可能导致你的固定剂干燥得太慢。当干燥时间影响染色体传播时,重要的是找到温度和湿度的正确组合,以优化用于细胞的染色体散布。[17]

关于准备中期传播的最后思考

一旦你的幻灯片变干,染色体固定在合适的位置,它们就准备好了下游应用,如免疫染色.在准备下一张幻灯片之前检查一下你的第一张幻灯片可能会有帮助。这样,你就可以根据你在显微镜下看到的染色体扩散情况来调整你的方法(比如距离、湿度和温度)。

首先,要记住完善中期传播是一门艺术!一步一步地遵循协议是一个很好的开始,但是您需要根据自己的需要优化方法。如果您需要一个可视化的协议或一些故障排除技巧,请查看来自培养细胞的染色体制剂由豪.[5]

对于你的染色体收获,你有什么解决问题的方法吗?请在评论中告诉我们。

引用:

  1. 王,n。“肿瘤细胞遗传学和分子细胞遗传学的研究方法",《美国医学遗传学杂志》2002年第115卷第3期,118 - 124页。
  2. Hochstenbach,R.等,“用全基因组测序代替出生后核型分析时未发现的、临床相关的染色体异常的调查“,欧洲医学遗传学杂志Vol.62(9),103543,2019。
  3. Bolhaqueiro, A, et al, "人类大肠癌类器官中持续的染色体不稳定性和核型进化“,自然遗传学Vol.51,824-834,2019。
  4. 三浦,M,等,”小鼠骨髓间充质干细胞染色体不稳定性的累积导致恶性转化“干细胞Vol.24(4),1095-1103,2006。
  5. Zulkipli, Ihsan N,等,”药用植物:靶向细胞分裂的潜在化合物来源《药物靶标洞察》2015年第9期,第9-19期
  6. 莫拉利,D。等,“一种改进的人ES和IPS细胞染色体分析技术“干细胞评测和报告卷。7,(2),2011年471-477
  7. 豪,B,等,”从培养细胞中制备染色体《可视化实验学报》2014年第83卷,50203卷。
  8. 舒克,p.l.等人,”在中期染色体上寻找损伤”。(编)DNA修复。《分子生物学方法》,1999年,2019年bob网站app。
  9. Finkelstein, Yaron等人,"秋水仙碱中毒:一种古老药物的阴暗面。“临床毒理学卷。48,5,007-414,2010。
  10. Rieder, C.等人,"秋水仙素与有丝分裂周期《细胞科学杂志》1992年第102卷387-397期。
  11. 新墨西哥州的米哈达特等人。”人类培养淋巴细胞中长春碱,芳细胞和血红素肠道遗传毒性评估:对比研究《北京交通大学学报(自然科学版)》,19(1),13-20,2016。doi: 10.1515 / bjmg - 2016 - 002
  12. 威廉斯,J,卡彭蒂耶里,u。胚胎中的中期抑制化合物”。《自然》1967年第216,613-614卷。
  13. 米歇尔兰等人,”原位杂交高质量中期扩散的可靠协议”。技术提示在线第3卷,126-127,1998。
  14. Kotsarenko, K.等人,”长期培养蜱细胞株的核型变化”。Sci Rep .10, 13443。2020.
  15. Utsumi, K.等人,”染色体I的研究I.用低渗溶液治疗揭示染色体的未磁化细胞结构与功能vol. 1, 93-99, 1975。
  16. Bakker, Bjorn等人"如何计数细胞中的染色体:当前和新技术概述《生物论文集:分子、细胞和发育生物学的新闻和评论》,第37卷,第5期,570-577,2015bob网站app
  17. 邓,W.等,“一种改进中期染色体扩散的新方法《细胞技术》,vol. 51A(1), 46- 51,2003。
  18. 珀贝克,j.l.等人,”染色体扩散动力学”。美国医学杂志;第61卷(4),387-393,1996。doi: 10.1002 / (SICI) 1096 - 8628 (19960202) 61:4 < 387:: AID-AJMG15 > 3.0.CO; 2 o。PMID: 8834053。
  19. Henegariu,O.等人,“细胞遗传学玻片制备的改进:可控染色体扩散、化学老化和逐渐变性“血细胞计数。43卷(2),101 - 109年,2001年。PMID: 11169574。
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