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如何获得完美的琼脂糖凝胶

加载琼脂糖凝胶以代表物品中给出的琼脂糖凝胶故障排除的尖端

每个研究实验室都有自己的做法方式,有些是如此标准,没有多少关注他们。琼脂糖凝胶肯定是这种情况。

琼脂糖凝胶是生物实验室中的多功能工具;你用它们以检查质粒制剂DNA提取,PCR结果,新克隆......有这样琼脂糖凝胶的许多用途你经常不考虑运行它们的最佳方式。

但是,当你的凝胶的形象看起来不太漂亮时,你希望你在你开始并通过更彻底的方式开始之前乘以额外的五分钟。

去过也做过。以下是要考虑的事情的一些起点(最好在您开始之前,但如果您最终结束了可怕的凝胶图片,并且无法弄清楚为什么每次都会获得图片完美的凝胶。

琼脂糖凝胶故障排除的顶级提示

tbe或不是tbe:选择正确的缓冲区

最流行的缓冲液是tae(tris-醋酸酯-EDTA)和TBE(TRIS-BORATE-EDTA)。您需要缓冲器来准备凝胶并填充凝胶将运行的腔室。

一般来说,实验室往往更喜欢另一个,但很好地了解差异,因此您可以为您的特定凝胶运行做出适当的选择。选择缓冲区时需要考虑的几点包括:

  • TAE最适合较大的DNA片段,而TBE最适合较小的DNA片段,因为它提供了更大的分辨率。
  • Tbe具有更大的缓冲能力,建议更长的凝胶运行;然而,TBE中的硼酸盐是一种酶促抑制剂,所以如果您计划使用DNA以供任何下游申请TAE是可以走的方式。
  • 随着时间的推移,TAE的股票更稳定,而TBE股票可以在几周内沉淀(提示:我通常使用TBE进行测定,所以我确保准备少量的5倍库存以避免降水)。

在为测定的目的选择最佳缓冲区时,请确保您考虑这些差异。

保持新鲜(缓冲区......)

在您决定哪些缓冲区最适合您的实验后,您应该总是有一个新鲜的等分试样,以准备凝胶并运行它。

通过新鲜,我的意思是新鲜稀释的缓冲液之前未使用过。可以保留5倍或10x缓冲液(在TAE的情况下更高)的库存,但确保在使用前稀释它。

不要重用以前的运行缓冲区 - 与必须再次运行整个实验以获得可用的图片,从未构成新鲜缓冲区的节省时间将可以忽略不计。当我只开始使用新鲜缓冲区时,我开始越来越尖锐,在我的样本中更均匀。好极了!

让凝胶拿走它的时间

这是最重要的提示:不要急于琼脂糖凝胶!你不希望你美丽的克隆结果毁了一个可怕的画面,因为你匆忙。

你必须在凝胶在75V以下并确保缓冲区不会过热。您可以通过在运行前冷却缓冲器和/或凝胶来降低过热的风险,或在冷室内运行凝胶。

小心大凝胶:它们可能在中心温暖,而边缘很酷。涂抹的主要原因之一,不均匀的带是缓冲液的温度。您可以(并且应该)避免维持大约50V至75V的恒定电压。

介绍事项

请记住,您的结果只是您呈现它的方式。没有办法让你的老板说服坏凝胶图片只是因为片段“有了”。不要浪费你需要通过冲凝胶跑步来实现数据的时间!

您是否有琼脂糖凝胶故障排除的任何提示?在评论中与我们分享他们!

资源

  1. Voytas D.琼脂糖凝胶电泳。目前免疫学方案。1992; 2(1):10.4.1-10.4.8
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2评论

  1. Bluskale. 2020年12月7日晚上5:58

    对于冒险,您可以在没有EDTA的情况下使您的TBE库存(TB,然后),然后稀释至0.5倍的强度。如果没有EDTA,缓冲器并不像较高的一样温暖,因此您可以执行更高的电压(例如200-250 V等,具体取决于凝胶的长度)。显然,具有4%的凝胶,甚至更高的电压(350V),您可以解析为DSDNA的约20bp。

    看 :https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4021863/

  2. Bjorn. 2020年12月7日晚上5:31

    它是电场强度(v / cm),而不是重要的电压本身。

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