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击败气泡:从膜蛋白样品中去除多余的洗涤剂6种方法

在泡沫中的泰迪熊的图像作为一个有趣的wa代表从膜蛋白去除多余的洗涤剂

如果您的研究涉及纯化膜蛋白, 我很同情你。这是一个繁重的任务。在实验室无数疲惫的月份之后,从进展中流放,您已经返回给您的主管抓住了一个合理纯粹的目标样本。

但它不活跃,不会结晶,并且缓慢促进溶液。

很可能你的问题是由于过量的洗涤剂。一小部分洗涤剂分子使您的膜蛋白样品水溶性保持溶解,而过量的洗涤剂阻断您的测定底物,使您的电子显微照片卷积,并胶上结晶相互作用。

让我们经历一些方法,您可以从膜蛋白中去除多余的洗涤剂,更好,更好地学习如何判断您是否已成功。

无论如何,为什么有过量的洗涤剂?

除非你打算将纯化的膜蛋白用于特定用途,否则你可能已经用洗涤剂

而且你已经在某处学到了你需要在100倍的情况下有洗涤剂临界胶束集中(CMC,洗涤剂分子自交换成胶束的浓度)有效地从细胞膜中提取靶。

因为你是聪明的,你意识到100x CMC的洗涤剂浓度很多,所以你在净化程序的每一步中逐步减少了它的浓度。

问题是大多数洗涤剂形成胶束,其具有与靶蛋白的相似之处相似的相对质量,以使其与另一个不可能的分离。结果是当您在预期实验之前旋转膜蛋白样品时,通常共浓缩洗涤剂胶束。

幸运的是,一些技术可以帮助去除膜蛋白的过量洗涤剂。对于未经审查的清洁剂可能导致蛋白质晶体的未经审查的例子,看起来不仅仅是图1。不要让你发生同样的事情。

击败气泡:从膜蛋白样品中去除多余的洗涤剂6种方法

图1。通过过量的n-十二烷基形成的拟羧β\在膜蛋白结晶实验中- d -麦芽糖(DDM)伪装成真晶体。(图片来源:托马斯·沃里克)

从膜蛋白去除多余的洗涤剂的6种方法

苯乙烯珠子吸附

多孔聚苯乙烯通过吸附真空吸尘器,并以品牌名称销售“生物珠子在你的样品中加入一些这样的东西,然后把那些讨厌的多余的洗涤剂封存起来。[1]

优点

  • 非常便宜,简单,只需要珠子和样品。
  • Bio-Beads可以通过普通化学品供应商购买。

缺点

  • 最佳的珠背样比需要实验测定,这反过来需要劳动力。
  • 通过剥离实际溶解它的洗涤剂分子,脱离洗涤剂的过度除去可析出溶液外溶液。如果不准确地确定珠叠样比率,则可以在洗涤剂上除去和除去。
  • 珠子还将吸附对样品功能至关重要的脂质。

2.尺寸排除色谱

任何纯化过蛋白质的人都可能已经完成了尺寸排除色谱(SEC)。这种技术根据分子的流体力学半径来分离分子,流体力学半径通常是分子相对质量的一个很好的代理。因此,您可以使用SEC从膜蛋白样品中分离多余的洗涤剂。[2]

优点

  • 在大多数蛋白质研究实验室中提供了执行该技术所需的套件。
  • 分析SEC色谱柱提供高色谱分辨率,并迅速运行。
  • 没有关于洗涤剂过度去除的问题。

缺点

  • 该方法仅在其溶解的洗涤剂的膜蛋白样品和胶束上仅作用,具有显着不同的流体动力学半径。如果不是这种情况,这两个物种都将从SEC列中加入,让您回到您开始的地方。

3.透析

“Protein Purification for Dummies” hasn’t been written yet, but when it does hit the shelves, I suspect dialysis will be on page 1. If you’re busy with other experiments or just have a lot of patience, detergent removal by dialysis may be the way to go. [3]

优点

  • 这种技术是被动的,所以你可以设置它,并在此期间继续进行其他工作。
  • 透析管非常便宜。

缺点

  • 并非所有蛋白质样品都耐受透析,所以您的膜蛋白样品可能会从溶液中沉淀出来。
  • 可能很难找到透析管,其孔径将允许过量的洗涤剂胶束,同时保留膜蛋白样品(通常是透析的个体洗涤剂分子,这就是透析缓慢的原因。
  • 实现显著的分离需要很长时间。如果您使用具有低CMC的洗涤剂,则需要更长时间更长时间

4.洗涤剂去除列

这些天真的有一切都是树脂。现在存在若干专有技术以从膜蛋白样品中除去过量的洗涤剂。

例如,HiPPR™和刺穿™洗涤剂去除旋转柱都可通过ThermoFisher。你的不含洗涤剂的样品很快就能拿到。

优点

  • 洗涤剂去除柱相对便宜。
  • 非常简单,执行,只需要列和微量离心机。

缺点

  • 如果您需要重复洗涤剂去除过程,请换取大量的塑料废物。
  • 如果膜蛋白样品在未经测试的洗涤剂中溶解,它可能无法正常工作。
  • 柱容量通常为低(通常>100μL),因此您可能需要一次性地将样品集中或旋转多个样品。

5.蛋白质降水量

故意沉淀膜蛋白样本出于解决方案可能听起来像是一个愚蠢的事情。

如果你能重申你的蛋白质体外但是,那么你有一种绝热的过度洗涤剂的绝佳方式。

简单地沉淀你的膜蛋白样品,通过离心将其制成颗粒,并将其折叠在含有所需洗涤剂浓度的样品缓冲液中。(4、5)

优点

  • 不需要执行特定文书。
  • 你可以决定洗涤剂的最终浓度。

缺点

  • 如果您可以重新折叠膜蛋白样品,则需要花费时间和样本体外
  • 在重新折叠样本成本后,为活动进行测定。

6.密度梯度超速离心

有趣的事实!超离心法测量使一名博士生能够提出一个非常精确的DNA结构,比詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克在1953年发表的DNA晶体结构整整早了5年。

超速离心机的其他漂亮应用包括细胞细胞器的分馏,[7]确定小颗粒的尺寸,[8],甚至分离出铀的同位素以产生核反应堆燃料。[9]

您还可以使用它们从膜蛋白样品中除去多余的洗涤剂。[10]

优点

  • 可以作为额外的净化步骤,因为相对质量不同的污染物会迁移到超离心管的不同部分。
  • 与其他洗涤剂去除技术相比,对样品进行比较温和。

缺点

  • 需要超速纤维。
  • 相关方法出版物仅涵盖有限的洗涤剂。

综述了去除膜蛋白中多余洗涤剂的方法

这是关于除去过量洗涤剂的不同方法的许多信息。为了使其更容易,这是一个表总结了每种方法的优缺点。

表1。本文讨论的洗涤剂去除方法的利弊概述。

洗涤剂去除方法 优点 缺点
苯乙烯珠子吸附 便宜且简单的表演


珠子可从普通的化学品供应商提供
需要实验测定最佳的珠子 - 样品

如果不能准确地确定最佳的珠-样洗涤剂去除率过高或过低
珠子还可以去除与膜蛋白样品的功能是一体的脂质
尺寸排除色谱 使用你们实验室里可能已经有的工具


不可能过度去除洗涤剂
如果你的膜蛋白样本和你选择的洗涤剂的胶束有相似的流体力学半径,就不会起作用

需要额外的下游处理膜蛋白样品
透析 便宜且简单的表演



使用你们实验室里可能已经有的工具
一般需要很长时间才能从膜样品中实现显色剂胶束的显着分离

您的膜蛋白样品可能不能耐受透析,并从溶液中沉淀出来
洗涤剂去除列 表现相对便宜和简单 低柱容量意味着只能处理少量的样品

不一定适用于所有的洗涤剂
蛋白质降水量 允许您确定确切的最终洗涤剂浓度 非常严厉的方法,不能保证能够在体外重新折叠膜蛋白样品
密度梯度超速离心法 对你的样本温柔 需要一个离心器

很多清洁剂都没有测试过

如何量化膜蛋白样品中的洗涤剂浓度

那么,你已经表演了你所选择的洗涤剂删除方法,但你如何确定程序是否成功?

您可以通过eriks读取方法纸张来获得全面的降低。[11]

总之,碘蒸气会使洗涤剂分子染色。通过在真空干燥器中缓慢加热碘晶体,你可以非常简单和安全地产生碘蒸气。

然而,随着碘蒸气剧毒的味道,请在通风橱中进行这件事。这可能是一个好主意阅读相关的安全数据也要和你的安全官员谈一谈,以确保你不会伤害任何人。

看哪的粉红色的雾。如果使用膜蛋白样品的常规薄层色谱(TLC)试验,抵御已知浓度的几种洗涤剂溶液,可以使用碘蒸汽来发展TLC板。

激光密度法可以使您从开发的TLC板上构建一个吸光度与洗涤剂浓度的校准图表。然后利用最佳拟合曲线的方程,你就可以计算出在你的膜蛋白样本中洗涤剂的浓度。

箴提示!如果你没有激光密度计,你可以对TLC底片进行高分辨率扫描,并使用图像分析软件,例如ImageJ.数字估计吸光度密度。

这些去除膜蛋白中多余清洁剂的方法有用吗?我是不是遗漏了你最喜欢的去除洗涤剂的方法?如果是,请在下面的评论中添加。

参考文献

  1. Rigaud JL等。(1998)用非极性聚苯乙烯珠去除洗涤剂EUR Biophys J.27.: 305 - 19
  2. 艾伦tm等。(1980)膜重建期间的洗涤剂去除Biochim Biophys Acta.601.:328-42
  3. Seddon am等人。(2004)膜蛋白,脂质和清洁剂:不仅仅是肥皂剧Biochim Biophys Acta.1666:105-17
  4. 姜l等。(2004)蛋白质组学分析前样品制备蛋白质沉淀方法的比较J ChromatogR A.1023.:317-20
  5. Doucette Aa等。(2014)用冷甲酸分解沉淀完整膜蛋白的质谱分析j蛋蛋白质res.13.: 6001 - 12
  6. Harding SE et al. (2018)DNA中氢键的发现及其结构的1948年的再评估物化学Soc反式46.: 1171 - 82
  7. Alberts B等人。(2002)细胞的分馏。在:细胞的分子生物学,第bob网站app4版。花环科学:纽约
  8. 卡尼·埃拉。(2011)用二维分析超离心法测定纳米颗粒的粒径分布及密度或分子量NAT CANCE2:335-42
  9. 他们fh(1971)超速异形分离重同位素J MECH ENG SCI13.:168-72
  10. Hauerf等人。(2015)分级机:单粒子Cryo-EM的膜蛋白复合体制剂结构23.:1769-75
  11. Eriks LR等。(2003)用于纯化膜蛋白纯化的洗涤剂的鉴定和定量策略学生物化学肛门323: 234 - 41
在泡沫中的泰迪熊的图像作为一个有趣的wa代表从膜蛋白去除多余的洗涤剂

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