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用于Y2H筛选的定量β-半乳糖苷酶测定的逐步指南

两只手摇动的图像代表定量酵母双杂交测定中蛋白质的菌群相互作用

如果你想找到一对蛋白质之间的相互作用,你已经遇到了酵母双杂交(Y2H)筛查,但你遇到了定量酵母双杂交屏幕吗?

刷新内存,以下是标准Y2H筛选背后的原理概述。这种技术的惊人方面是您可以量化反应,并比较多对蛋白质之间的物理相互作用的相对强度,您所要做的就是挑选正确的报告基因。

标准定性Y2H测定使用报告基因Leu2 / URA3.其中蛋白质之间的相互作用将使菌株在缺乏亮氨酸/尿嘧啶的培养基上生长。另一方面的定量Y2H测定使用报告基因编码\ beta.- 高透明酶/荧光蛋白,您可以通过各相互作用量量化各相互作用产生的酶/荧光量,并比较不同对蛋白质的结合强度。

在本文中,我们将带您完成\ beta.- 高烷基酶(\ beta.-gal)测定,使用该易于廉价的测定大肠杆菌Lacz.基因产生这一点\ beta.- 作为记者的高烷基酶。我将右转到追逐并解释一步。

定量酵母两杂交屏的4个步骤

第1步:质粒获取

为了\ beta.-gal测定,你需要三种质粒。

  1. 诱饵质粒:这对其与转录因子的DNA结合结构域融合的蛋白质的一种蛋白质。
  2. 牺牲性质粒:这对与转录因子的活化结构域融合的另一个感兴趣的蛋白质编码。
  3. 记者质粒:这包含了Lacz.基因具有上游启动子的复合转录因子结合。

提示:

  • 使用诱导型启动子给记者质粒,确保同时激活Lacz.所有菌株中的基因。加尔典型使用的启动子,因为它们在半乳糖存在下容易诱导并在葡萄糖介质中抑制。
  • 以利用加尔启动子,您的左右蛋白质需要与转录因子Gal4的激活结构域融合。gal4将与之绑定到加尔在半乳糖存在下存在的启动子,诱导下游Lacz.表达。
  • 对于您的诱饵质粒,使用原核蛋白质的DNA结合结构域在酵母中没有同源物,以避免假阳性信号。

第2步:应变生成

这部分很容易。您需要用记者,诱饵和猎物质粒转化酵母菌株。您可以使用电力竞争力或化学富集的细胞在菌株中插入质粒。您可以同时用所有三种质粒进行与所有三种质粒进行共转换,也可以一次插入质粒。

最后,成功转化的细胞将基于基于毒细胞植物标记的三重脱落媒体生长您的质粒编码。酵母中的一些常用的氛围标记是URA3,LYS2,LEU2,TRP1,HIS3,MET15,阿德2

让我们说你的诱饵质粒编码Leu2.,你的猎物质粒编码TRP1,和你的记者质粒编码URA3:在这种情况下,您的转化体将在Leu-TRP-合成介质上生长。

专家提示:

始终用记者,猎物和一个不编码任何感兴趣蛋白质的空诱饵质粒进行压力;这将有助于您了解基线报告基因表达和测量信号强度。

第3步:细胞生长和记者诱导

既然你用质粒正确组合制作了你的菌株,是时候让它们尽可能多的拷贝数并诱导报告基因。要有效地执行此操作,请记住以下内容:

  1. Grow the strains to mid-log phase in the appropriate selective media in presence of glucose;酵母容易利用葡萄糖来快速繁殖,而是将压制Lacz.基因表达。重要的是在三重辍学媒体中生长菌株,否则细胞可能会丧失质粒。以下是增长曲线的不同阶段的复述。
  2. 测量外径600培养物并计算每个培养物的体积,以获得每个菌株的相同数量的细胞。例如,如果od600菌株A为0.25,菌株B的菌株为0.5,您将收获20mL每10毫升B.
  3. 收获计算的细胞体积并用冷灭菌水洗涤以除去任何葡萄糖痕迹。
  4. 在感应培养基中转移细胞(适当的脱落介质+半乳糖),并让它们增长至少两个倍增时间。普通实验室酵母菌株的倍增时间约为90分钟;如果您正在处理突变菌株,往往会通过细胞周期缓慢进展,您可能希望运行生长曲线实验,并找出您的菌株的倍增时间。

半乳糖将激活GAL4转录因子并诱导Lacz.表达如果您感兴趣的蛋白质是物理相互作用。

专家提示:

向您的感应介质加入1%w / v raffinose以增强Lacz.表达。诸如奖石等碳源有助于缓解葡萄糖抑制加尔促进剂,而半乳糖诱导它们的表达。

第4步:细胞裂解和\ beta.- 高碳糖苷酶活性定量

记者归纳后,你的测定体外

  1. 在合适的裂解缓冲液中收获并粘合细胞以收集全细胞提取物(WCE)。WCE包含\ beta.由每个菌株产生的 - 由于诱饵和牺牲性质粒的物理相互作用而产生的羟氢酶。
  2. 添加比色衬底以可视化酶表达。最常用的底物是邻硝基苯基 -\ beta.-d-半乳糖醇(ONPG)。这种无色化合物产生黄色O.- 水解时 - 硝基苯酚最终产品\ beta.-半乳糖苷酶。将WCE与ONPG一起培养,并记录产生可见黄色所需的时间;这是你的反应时间。反应时间越长,产生的黄色越多,因此记录每个反应的持续时间以标准化每个样品中的酶活性很重要。
  3. 在420nm和550nm处读取样品的吸光度,并计算单位\ beta.- 高烷基酶生产如下:

u = \ frac {1000 \ times [\ textrm {abs} _ {420} - (1.75 \ times \ textrm {abs} _ {550})]} {t \ times v \ times \ textrm {abs} _ {600}}

在哪里:

u =单位\ beta.- 高烷基酶
ABS420.=黄色吸光度O.- 硝基苯酚
ABS550.=其他细胞产品吸光度​​。当乘以1.75时,该值模拟420nm的细胞碎片散射。从中扣除此值O.- 420nm的 - 硝基苯酚吸收消除了背景吸光度和标准化O.- 每个样品的硝基酚吸光度。
ABS600=细胞吸光度,代表原始细胞浓度
T =在几分钟内反应时间
v =毫升中的反应体积。

在图中绘制您的计算值,标准化为空饵控制和voila!您现在知道哪种蛋白质是强烈的相互作用,哪种蛋白质不会相处得很好。

提示:

  • 执行体外在微量滴定板中的比色测定以在板读数器中同时读取所有样品的吸光度。如果不可能,加入1米碳酸钠(Na2CO.3.)在开始一次吸收吸光度读数之前,停止溶液。na的高pH2CO.3.瞬间变成了这一点\ beta.- 所有样品的高烷基酶并确保反应时间是均匀的。
  • 标准化\ beta.- 对每种菌株产生的总蛋白质的高烷基酶活性。留出50.\亩你为的WCE的l\ beta.- 高透明酶测定并进行Bradford或Lowry测定以定量蛋白质浓度。绘制每个相互作用产生的酶活性作为单位\ beta.- 总蛋白质的高烷基酶/ mg。
    您的最终产品将看起来像这样的东西:

定量酵母双杂交测定结果的Excel图表

图1。示例显示了\ beta.- 通过Y2H测定中的每种相互作用产生的 - 高透明酶。

在这个完全制作的图表中,看着金额\ beta.每次相互作用产生的 - 高碳糖苷酶您可以说,您的空诱饵控制并不与猎物质粒相互作用,如您所期望的那样。蛋白质A与蛋白质B和适度与蛋白质C.蛋白质B和C的蛋白质B和C强烈相互作用。

就是这样。您已准备好进行定量酵母双混合屏幕。我希望你的蛋白质很好地相处得很好!

两只手摇动的图像代表定量酵母双杂交测定中蛋白质的菌群相互作用

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