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选择荧光蛋白的终极指南

荧光灯的图像表示选择荧光蛋白

无论您是刚刚开始使用荧光蛋白,需要帮助选择一个或已经是经验丰富的专业人士,这篇文章都会深入了解该领域的发展以及如何为您的工作选择荧光蛋白。

您可能熟悉绿色荧光蛋白(GFP),它在应用中的生物技术历史悠久体外蛋白质标记为更广泛的工作研究了细胞蛋白的结构性和表达。GFP和其几种变体(例如,EGFP,SFGFP,MUGFP)几乎可以在几乎每个生物化学实验室发现,并且由于他们的普及和可用性而是一个转移。

有了这一说,现在有数百种不同的量身定制的荧光蛋白,您可以选择,可以改善您的实验和项目。不仅有具有非常特异性的激发和发射波长的选择,而且存在新的和不同的蛋白质,以减少毒性并最大化在可见光谱上的亮度。

简而言之,探索荧光蛋白质世界中的巨大血清选项可能会提高您的结果,并使您成为更好的研究人员!

选择荧光蛋白时的6个考虑因素

亮度

由于其个体性质和结构,荧光蛋白表现出一系列亮度。在选择的排放范围内选择最亮的蛋白质,似乎是一个无意识的蛋白质,您将想记住,理论亮度并不等于您的实验设置中的“实用”亮度。

蛋白质的实际亮度可能因折叠差异而有所不同(基于它附加到的)或您使用的细胞系列。考虑测试符合您实验需求的多种蛋白质,并建立一个具有控制条件的“基线”。

2.稳定性

如上所述,如果您选择的荧光蛋白没有正确折叠,它可能根本不能荧光!荧光团的结构完整性可以根据链接的地点和方式而改变或损害。

您可能想要尝试将荧光蛋白与您感兴趣的蛋白质的N-或C-末端联系起来以确定最佳连锁。虽然C-末端标记的蛋白质最常见并且与预期的往往比N末端标记的蛋白质更常见,但情况并非总是如此。

其他因素,如细胞系和pH可以影响荧光蛋白表达和荧光。

幸运的是,定向的演化工作导致“增强”和“超稳定”荧光蛋白,其在细胞系中持续更长的细胞系,温度较高,更广泛的pH范围。有些人甚至可以在涉及化学苛刻的组织清除方法的细胞系工作流程中保持活跃。

3.光稳定性

Photoblaching是所有荧光团的属性,导致分子的荧光特性的不可逆破坏。这包括荧光蛋白质!对于活细胞成像或具有长时间失效的其他实验,考虑具有高光稳定性的荧光蛋白。漂白半衰期越长(或每秒X光子的初始排放率的时间减少到一半),荧光蛋白越波。

4.毒性

一些荧光蛋白对特定细胞系具有毒性作用。虽然不完全明白,荧光蛋白表达引起的细胞损伤可以由反应性氧物种产生,引发细胞凋亡,免疫机制损伤 - 更不用说蛋白质的四聚化和聚集行为。

通过在潜水到实验前探讨之前审查文献,良好地了解您考虑的蛋白质及其对细胞的影响。

5.实验设置

您的实验限制和期望可以说是决定使用哪种荧光蛋白的最关键因素。

例如,您的实验可能不需要一个相互作用(如在FRET中的多个荧光蛋白,以确定两个目标的相互作用)。也许你正在运行一个需要很少的自发荧光的实验,或具有特定的动力学或荧光周转周转需要。

同样重要的是,您需要核实您的选择蛋白质与显微镜光学和过滤器组兼容。向您的同事,核心设施工作人员和文献识别您的需求是什么,并根据这些因素选择荧光蛋白。

6.成本和可用性

幸运的是,最常用的荧光蛋白的遗传序列很容易获得,并以各种载体阵列(以下更好!)。获得和使用荧光蛋白比以往更便宜,更容易!

为什么考虑一种新的荧光蛋白?

生物化学家和生物学家已经无情地致力于工程师新的和改进的荧光蛋白,以帮助解决上面列出的问题。

通常,蛋白质中的关键位置的一些变化显着提高了稳定性,亮度和光稳定性。即使您觉得使用特定蛋白质的“落户”,您也应该在定期审查是否是您工作的最佳选择。

一个这样的例子是GFP。考虑今天野生型超出了许多存在的品种!对于荧光蛋白的不同调色板,正在进行改进。由于科学总是向前行进,因此不要犹豫,探索您或您的实验室的替代方案并未传统使用。

例如,“分裂”荧光蛋白领域的开发,其中蛋白质重新组装以形成完全官能的版本的片段导致自互补的表位标签系统。

该技术允许研究人员添加相对小的肽标签而不是全蛋白质,允许更大的通用性和稳定性。例如,“suntag”序列导致多达24 GFP与靶蛋白相关联!

另一个例子是许多例子MCHERRY的新变种设计红移荧光和减少细胞毒性。

一些流行的荧光蛋白

以下是一些最常用和众所周知的荧光蛋白,包括它们体内结构体。请记住,这只是今天可用的广泛宽度的少量广泛!对于更全面的表格,包括更多蛋白质和细节,请在荧光蛋白中查看此引物microscopyu.com.

荧光蛋白 励磁

(纳米)

排放
最大限度
(纳米)

相对的
亮度
(百分比的百分比)

量子产量 磨牙
灭绝
系数(M.-1厘米-1

体内
结构

绿色荧光蛋白
GFP(WT) 395/475. 509. 48. 0.77 21,000 单体*
egfp. 484. 507. 100. 0.60 56,000 单体*
超级折叠器GFP. 485. 510. 160. 0.65 83,300 单体*
T-Sapphire. 399. 511. 79. 0.60 44,000 单体*
蓝色荧光蛋白
EBFP2. 383. 448. 53. 0.56 32,000 单体*
MTAGBFP. 399. 456. 98. 0.63 52,000 单体
青色荧光蛋白
mturquoise. 434. 474. 75. 0.84 30,000 单体*
CYPET. 435. 477. 53. 0.51 35,000. 单体*
MTFP1(TEAL) 462. 492. 162. 0.85 64,000 单体
黄色荧光蛋白
黄玉 514. 527. 169. 0.60 94,500 单体*
麦克里丁 516. 529. 174. 0.76 77,000. 单体
ypet. 517. 530. 238. 0.77 104,000. 单体*
Zsyell1. 529. 539. 25. 0.42 20,200 四聚物
麦巴纳 540. 553. 13. 0.7 6000 单体
橙色荧光蛋白
Kusabira Orange2. 551. 565. 118. 0.62 63,800. 单体
生理 548. 562. 146. 0.69 71,000 单体
Dtomato. 554. 581. 142. 0.69 69,000. 倍二
TAGRFP. 555. 584. 142. 0.48 10,000. 单体
DSRED. 558. 583. 176. 0.79 75,000 四聚物
mtangerine. 568. 585. 34. 0.30 38,000. 单体
红色荧光蛋白
MRUBY. 558. 605. 117. 0.35 112,000 单体
映射 568. 592 109. 0.49 75,000 单体
Mstrawberry. 574. 596. 78. 0.29 90,000 单体
麦克里 587. 610. 47. 0.22 72,000 单体
MRASPBERRY. 598 625. 38. 0.15 86,000. 单体
mplum. 590. 649. 12. 0.10 41,000 单体
*弱二聚体

帮助您选择(和使用!)正确的蛋白质

幸运的是,荧光蛋白广泛可用并在全球实验室中使用。在接受含有蛋白质的质粒的日子已经一去不复返了,这些质粒产生了您选择的蛋白质基因(或者更糟糕的是,必须自己克隆)是一个多月的磨削。考虑下面的资源以选择和采购荧光蛋白。

发表的文献

您可以从出版文献中找到有用的资源,从查看其他人在您的领域或技术中使用的荧光蛋白质,并保持最新的荧光蛋白,或通过对该主题的评论的评论。[2,3]

您的实验室/合作者

如果您的实验室或周围的实验室和合作者已经使用荧光蛋白,他们可能能够为您的申请提供良好的建议。它们甚至可以提供合适的荧光蛋白。使用现有本地资源通常是最方便且经济高效的选项。

FPBase.

FPBase.是一个在线数据库,提供相关的荧光蛋白信息,包括序列和进化的时间表,超过750个蛋白质 - 随着用户添加条目,它们不断增长![4]

他们的互动光谱观察者和表格,其中细节如寡聚化型,蛋白质大小和亮度,对于寻求全面搜索的人来说特别有用。每种条目包括它源自原有的蛋白质,允许您查看单一蛋白质的多个版本是如何相关的。

奥林巴斯彩色调色板

普遍的显微镜公司奥林巴斯也有一个合理详细的蛋白质清单通过发射波长组织,包括几种变体的简要历史。重要的是,奥林巴斯提供有关滤波器类型的建议和与任何细胞显微镜用户相关的进一步细节。虽然不是所有变体的详尽清单,但它是使用生物荧光团的那些新的出发点。

质粒储存库

一旦您决定使用新的尖端荧光蛋白为您的工作,您可能需要在载体中获得遗传序列进行转化或转染。

addgene是最着名的储存库之一,具有大量的收集,包括质粒。

他们方便地组织了含荧光蛋白基因的质粒的一系列质粒,并通过使用对其进行分类。您还可以根据日本商店或扭曲生物科学等公司定制订单遗传序列,并将其插入您选择的向量。

bob综合博彩

当然,BiteSizebob综合博彩 Bio具有丰富的文章,这些文章审查了荧光团的基础知识故障排除技术。从棕榈成像自动显微镜,我们让你覆盖了。并且别忘了看看显微镜播客剧集丽塔策略,世卫组织设计了几种改进的红色FP DSRED变种!

您是否对独特应用有任何最喜欢的荧光蛋白,或者您在实验室中有“升级”以获得更好的结果?或者你是新的要使用它们并想要了解更多信息吗?让我们在下面的评论中了解!

参考

  1. Palmer E&Freeman T.(2004)使用逆转转染微阵列对亚细胞定位研究使用C-和N-末端GFP融合蛋白的研究Comp Funct基因组学5.(4):342-53。
  2. Shaner N.等等。(2005)选择荧光蛋白的指南。自然方法2:905-909。
  3. Lu K,VU CQ,。(2019)基于荧光蛋白的生物分子活性功能超分辨率成像的基于荧光蛋白的指标int j mol sci20.(22):5784。
  4. Lambert T.(2019)FPBase:一个社区可编辑的荧光蛋白数据库。自然方法16.:277-278。
荧光灯的图像表示选择荧光蛋白

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