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点亮RNA适配体:照亮RNA的世界

图中彩色的小点代表了RNA与被点亮的RNA适配体的可视化。

2008年,下村修,Martin Chalfie钱永健(Roger Y. Tsien)因“发现和开发绿色荧光蛋白GFP”而获得诺贝尔化学奖。没有人感到惊讶,因为使用荧光蛋白彻底改变了蛋白质研究。荧光蛋白使从分子生物学-重组dna时代过渡到细胞生物学时代:研究生物分子bob网站app体内。但是你有没有想过如何形象化这个极其困难的分子,RNA?在这篇文章中,我们将向您展示如何使用被点亮的RNA适配体。

可视化RNA的问题

用同样的方法融合RNA的报告分子和目标分子是很棘手的,因为它们比蛋白质更不稳定。

当然,有很多方法可以了解RNA动力学。例如,可以用RT-PCR来研究样本中特定RNA分子的数量。细胞rna可以在组织中看到使用修改荧光原位杂交(鱼)RNA -伊什-通过杂交荧光寡核苷酸探针到目标rna。但是ISH需要用相关的伪影进行组织修复。而且它不允许对RNA代谢的动态过程进行研究,而荧光蛋白可以对蛋白质进行研究。

引入荧光RNA适配体

幸运的是,还有另一种研究RNA动力学的方法——荧光RNA核酸适体。适配体是一种可以折叠成特定的三级结构的寡核苷酸,可以结合特定的目标。

在一个核酸适配体的末端添加一个荧光标记,选择mRNA作为一个结合目标,你就得到了类似FISH的东西,但是是在活细胞中工作的适配体也可以作为代谢物或RNA分子标签末端的独立传感器。

什么是LURA?

发光RNA适配体(Light-Up RNA Aptamers, LURAs)是内源性RNA,结合非荧光小分子后发出荧光。与适体结合后,分子的能量在自由态时消散为荧光(图1)

点亮RNA适配体:照亮RNA的世界
图1所示。LURA是如何与非荧光的荧光素结合而产生荧光的。图片来自Ouellet[1],发表于知识共享许可CC BY 4.0。

LURAs的例子包括Hoechst染料衍生物,可以结合到29个核苷酸长的RNA蓝色荧光适配体。[2]

RNA适配体是如何附着的?

适体可以附着在几乎任何RNA分子的末端,而不会干扰它们的功能。核酸适配体在转录后立即开始发挥作用,这阻止了蛋白质标签在发挥作用之前所经历的步骤,即翻译和折叠。

用SELEX筛选新的RNA适配体

新的适体是从“配体指数富集的系统进化”(SELEX)中获得的。

简而言之,SELEX是一个广泛的寡核苷酸文库,由随机生成的序列组成,两侧有恒定的5 '和3 '端。这些末端起着引物的作用。文库序列与目标分子混合,不与目标结合的分子通过亲和层析或顺磁珠上的目标捕获去除。

最后,结合的寡核苷酸被洗脱和PCR扩增,为后续的几轮选择。

发光RNA适配体可以研究什么?

您可以使用LURAs询问许多研究问题,从新陈代谢到翻译。你只需要有创造力,阅读文献。例如:

  • LURAs可以起核糖开关的作用。核糖开关是RNA的一部分,它在与代谢产物(如重要的酶辅因子s -腺苷-甲硫氨酸(SAM))结合后,以稳定的结构折叠并改变荧光。[3]
  • LURAs可用于研究RNA的合成和转运。(4、5)
  • LURAs可用于细胞内病毒DNA动力学。[6]

目前可用的寡核苷酸适配子

最早被开发出来的适配体之一结合了一个绿色荧光团:3,5-二氟-4-羟基苄叉咪唑啉酮(DFHBI),并被想象地命名为“菠菜”。(令人困惑的是,上面列出的应用与植物毫无关系。[3,4])不幸的是,37?并需要tRNA支架在体内发挥作用。(1、7)

将SELEX与FACS结合,使用菠菜的衍生物Spinach2作为选择起点,可以选择一个与配体亲和力更好的新的LURA。名为西兰花的49个核苷酸长的RNA寡核苷酸激活DFHBI或DFHBI- 1t的荧光。它还提高了细胞内的稳定性。[8]

以水果和蔬菜为主题,39个核苷酸长的适配体结合乙酰化的三唑橙被命名为“芒果”。芒果是具有荧光的下一代适配体,可以持续数小时而不是数秒。它结合三唑橙乙酰化(TO1)的衍生物。如果它在第二步被生物素化,它被称为to1 -生物素。[1]

截至2021年,已有数十种具有荧光团颜色(从黄色到蓝色)的适体,而且数量还在不断增加(表1)。

的名字 荧光团 Kd (nM) 亮度(varepsilon * ^{复})
菠菜 DFHBI 540 17.5
Spinach2 DFHBI-1T, DFHBI-2T 560 29.1
西兰花 DFHBI-1T 340 27.8
芒果 1、3 3. 10.85
红椰菜 DFHO 206 11.9
玉米 DFHO 70 7.25
MG适配子 孔雀石绿 117 28.0
SRB适配子 专利蓝 23 N/A

表1。最常用的发光适体(表改编自Bouhedda).[9];参见更多示例和主要参考资料)

正如你从表中看到的,第一代“蔬菜”适配子不是很聪明,通常低于中等表达水平的GFP。但别担心,有一种新的作物可以克服这个问题。“胡椒”核酸适配体最初被开发用于结合不稳定的荧光肽。第二代辣椒结合了8种荧光染料,从青色到红色,还有一些可以共表达。[10]

如何获得发光的RNA适配体?

如果现有的适体能够帮助你回答你的研究问题,那你就很幸运了。如果你想把LURAs应用到一个新的研究问题上,这是一个可以比作为你选择的蛋白质获得一种一抗的任务。

你可以自己开发一个所需的LURA,为你的简历添加一项有价值的技能,或者购买它,节省时间,可能提高你成功的机会。对于大型生物技术公司来说,这是一项太过利基和前沿的技术,它们不会感兴趣,但小型生物技术公司会帮助你。

为了了解更多关于RNA适配体和它们的发展,并理解为什么它们主要以蔬菜命名,请收听丽塔·斯特拉克主持的《显微镜学家》播客他参与了荧光蛋白和RNA适配体(包括Spinach2)的开发。

您在研究中使用了lura吗?请在下面的评论中告诉我们!

参考文献

  1. Ouellet j . (2016)RNA荧光与发光适配体前化学4: 29。
  2. 张志刚,张志刚(2008)。利用融合RNA与染料结合的发光适配体作为标签的转录监测:蓝色荧光RNA化学。Commun。剑桥市英格兰。33: 3858 - 60。
  3. 宋文杰(2012)。RNA细胞代谢物的荧光成像科学335(6073): 1194
  4. 吴桂英(2011)。绿色荧光蛋白的RNA模拟物科学333: 642 - 646。
  5. Strack RL,迪士尼总经理,jeffrey SR. (2013)超折叠菠菜2揭示了含有三核苷酸重复序列的RNA的动态特性Nat方法10(12): 1219 - 1224。
  6. Nilaratanakul V, Hauer DA, Griffin DE. (2017)编码荧光RNA适配体Spinach2的辛德比斯病毒的开发和表征,用于细胞内病毒RNA复制的成像和免疫介导的变化J创性研究98(5): 992 - 1003。
  7. a·温斯坦(2019)。适体汤中的荧光蔬菜Blog.addgene.org
  8. 菲洛诺夫,G. S.,穆恩,J. D., Svensen, N.,和杰弗里,S. R.(2014)。西兰花:通过基于荧光的选择和定向进化,快速选择绿色荧光蛋白的RNA模拟物j。化学。Soc。136: 16299 - 308。
  9. Bouhedda F, Autour A, Ryckelynck M. (2017)发光RNA适配体及其同源荧光素:从它们的发展到应用国际医学期刊19(1): 44。
  10. 斯特拉克,r (2019)一撮辣椒Nat方法16: 1075。

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