跳到内容

sds - page是如何工作的

一个孩子在做科学。他们对SDS-PAGE的工作原理感到惊讶

SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳)通常用于实验室,用于基于其分子量分离蛋白质。这是通常使用但不完全理解的那些技术之一。所以让我们尝试通过解释SDS-Page如何工作。

使蛋白质迁移速率与分子量成正比

关于SDS-PAGE如何工作,首先要知道的是,它根据蛋白质的分子量分离蛋白质,这是基于它们在外加电场影响下通过筛分基质(凝胶)的不同迁移速率。

任何带电物质通过电场的运动是由其净电荷、分子半径和外加电场的大小决定的。但天然折叠蛋白的问题是它们的净电荷和分子半径都与分子量无关。

相反,它们的净电荷由氨基酸组合物确定,即蛋白质的三级结构的蛋白质和分子半径中的正和阴性氨基酸的总和。

因此,在其本地状态下,具有相同分子量的不同蛋白质将根据其电荷和3D形状以不同的速度迁移。

为了在电场中仅根据分子量分离蛋白质,我们需要破坏三级结构,将蛋白质还原为线性分子,并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的作用。

SDS的作用(et al。)在SDS-PAGE如何运作

SDS是一个洗涤剂存在于SDS-PAGE样品缓冲液中,其中以及一点沸腾和还原剂(通常是DTT或\ beta.-ME分解蛋白质-蛋白质二硫键),它破坏了蛋白质的三级结构。这就把折叠的蛋白质变成了线性分子。

SDS还将蛋白质包裹上均匀的负电荷,从而掩盖了r -基团上的固有电荷。SDS与线性蛋白质的结合相当均匀(约为1.4g SDS/ 1g蛋白质),这意味着蛋白质的电荷现在大致与其分子量成比例。

SDS也存在于凝胶中,以确保一旦蛋白质是线性化并且它们的电荷掩盖,它们在整个运行过程中保持这种方式。

确定SDS涂覆蛋白迁移率的显性因素是其分子半径。已显示SDS涂覆的蛋白质是线性分子,宽度为18埃,并且长度与其分子量成比例,因此分子半径(并因此在凝胶中的迁移率)由蛋白质的分子量确定。

由于SDS涂覆的蛋白质具有相同的电荷质量比,因此没有基于电荷的差异迁移。

凝胶矩阵

在外加电场中,sds处理过的蛋白质会根据其分子量以不同的速率向正极移动。由于凝胶基质的高摩擦环境,这些不同的流动性将被夸大。

如名称表明,用于SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺,这是一种良好的选择,因为它是化学惰性的,并且至关重要的是,可以容易地以各种浓度构成以产生不同的孔径,以产生各种分离的不同孔径可以根据您的需求进行更改的条件。

您可以了解更多信息丙烯酰胺聚合的机制在这里

起跑线排列:不连续缓冲系统和堆叠凝胶

不连续的缓冲系统解释

为了使电流从阴极(负极)通过凝胶传导到阳极(正极),显然需要一个缓冲液。大多数使用不连续的Laemmli缓冲系统。“不连续”只意味着凝胶和罐中的缓冲器是不同的。

通常,该系统在pH6.8处用Tris-HCl缓冲的堆叠凝胶设置,通过Tris-HCl缓冲至pH8.8的运行凝胶和pH8.3的电极缓冲液(图1)。堆叠凝胶具有低浓度的丙烯酰胺,因为我们不希望蛋白质分离,而运行凝胶具有更高的浓度,能够延长蛋白质的运动。

sds - page是如何工作的
图1。SDS-PAGE设置显示堆叠凝胶,运行凝胶和电极缓冲器的pH。

那么所有不同的小腿都有什么?

甘氨酸可以以三种不同的电荷态存在:正电荷态、中性电荷态和负电荷态,这取决于pH值。

这如下面的图表所示。不同缓冲液对甘氨酸电荷状态的控制是整个叠胶过程的关键。

sds - page是如何工作的

图2。甘氨酸的三个充电状态。

堆叠凝胶在SDS-PAGE中是如何工作的

这就是堆叠凝胶的工作原理。当电源打开时,pH为8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入pH为6.8的堆积凝胶中。在这种环境下,甘氨酸主要转换为两性离子(中性带电)状态。这种电荷的损失导致甘氨酸离子在电场中移动非常缓慢。

另一方面,在电场中移动得更迅速(从Tris-HCl),并且它们形成了一个离子前部,在甘氨酸之前迁移。

Cl-与Tris反离子(现在正向阳极移动)的分离产生了一个带有陡峭电压梯度的狭窄区域,将甘氨酸离子拉到它后面,导致两个移动离子的战线分离得很窄;高流动性的Cl-前沿,其次是较慢的,大部分中性的甘氨酸前沿。

凝胶样品中的所有蛋白质具有电泳迁移率,其在甘氨酸和Cl-的迁移率的极端之间中间体,因此当两个前沿扫过样品井时,蛋白质将浓缩到CL之间的窄带中。- 和甘氨酸前面。

他们是休息!

该游行携带,直到它击中运行凝胶,其中pH切换到8.8。在该pH下,甘氨酸分子大多是带负电的,并且可以比蛋白质更快地迁移。所以甘氨酸前面加速了蛋白质,将它们留在灰尘中。

结果是,蛋白质在堆积和流动凝胶界面的一个非常窄的带中被丢弃,由于流动凝胶的丙烯酰胺浓度增加,根据蛋白质的大小减慢了蛋白质的移动,分离开始了。

这一切到底是怎么回事?

如果你仍然想知道为什么需要堆叠凝胶,想想如果你不使用它会发生什么。

凝胶井深左右1cm,你通常需要基本上填充它们以获得足够的蛋白质到凝胶上。因此,在没有堆叠凝胶的情况下,你的样品将坐在运行凝胶的顶部,作为高达1cm深的乐队。

而不是排队在一起并将运行的凝胶排成在一起,这意味着样品中的蛋白质将全部进入不同时间的运行凝胶,导致非常涂抹的带。

因此,堆叠凝胶确保所有的蛋白质在同一时间到达流动凝胶,所以相同分子量的蛋白质会以紧密的带迁移。

SDS-PAGE如何运作的最终步骤:分离

一旦蛋白质进入流动的凝胶中,它们就会分离,因为相对分子质量较高的蛋白质在多孔丙烯酰胺凝胶中移动的速度比相对分子质量较低的蛋白质要慢。凝胶中孔的大小可以通过改变丙烯酰胺浓度来改变你想要分离的蛋白质的大小。典型值如下表1所示。

丙烯酰胺(%) 兆瓦范围(KDa)
7. 50 - 500
10. 20-300
12. 10 - 200
15. 3 - 100

对于更广泛的分离范围,或难以分离的蛋白质,梯度凝胶可以使用增加丙烯酰胺浓度的层。

我想这就是SDS-PAGE的工作原理。如果你有任何问题,更正或任何需要补充的,请在评论区参与进来!

最初发表于2008年9月18日。2021年8月修订和更新。

一个孩子在做科学。他们对SDS-PAGE的工作原理感到惊讶
图片来源:劳尔•梅利亚

92条评论

  1. 阿拉迪·莫里亚 2019年5月20日上午6点51分

    为什么只使用甘氨酸氨基酸在SDS相而不是其他氨基酸中使用
    丙氨酸也可以以中性和两性离子的形式存在。



滚动到顶部
分享Via
复制链接